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1、CRISPR-Cas系统基因 修饰技术1 CRISPR-Cas概述u1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的 DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。u2013以后，研究者们在包括science和nature biotechnology等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。1 CRISPR-Cas概述CRISPR-C
2、as：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。CRISPR-Cas主要由两部分组成 ：识别切割1 CRISPR-Cas概述1.1 CRISPR结构CRISPR： （clustered regularly interspaced short palindromic repeats ）CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常 2148 bp, 重复序列之间被 2672 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序
3、列（space）与靶基因进行识别。1.1 CRISPR结构1.2 Cas家族Cas（CRISPR associated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。2 CRISPR-Cas系统的发现CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。2 CRISPR-Cas系统的发现2 CRISPR-Cas系统的发现2 CRISPR-Cas系统的发现CRISPR-Cas系统赋予原核细胞
4、针对外源DNA特异性免疫, 而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。2 CRISPR-Cas系统靶向要求最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。2 CRISPR-Cas系统靶向要求在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM 。2 CRISPR-Cas系统靶向要求3 CRISPR-Cas系统介导基因修饰3.1 dual-RNA：Ca
5、s介导编辑模板替换2013年1月29日在nature biotechnology上发表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用CRISPR-Cas系统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰2013年1月29日在nature biotechnology上发表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一
6、文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰Cas9sg-RNA2013年2月15日在science上发表的Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰 3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰 4 CRISPR-Cas系统前景分析
7、这是一项靶向基因修饰的革新技术，一项极具有 可能获得诺贝尔奖技术。4 CRISPR-Cas系统前景分析2013年4月12日在cell stem cell上发表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者利用TALENs和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为0%-34%和51%-79%。4 CRISPR-Cas系统前景分析而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要
8、重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。4 CRISPR-Cas系统前景分析u 只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。u 编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便。u 较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。技术优势1987年，当时有一个科研小组观察到，在细菌编码的一个基因末端有一段 非常奇怪的重复序列。 越来越多的生物学家们开始从事微生物基因组的解析工作，这时他们也都 发现了这种奇怪的现象 在大约40%的细菌和90%的古细菌（archaea）中都能够观察到
9、这种现象 ，于是科学家们给这种序列取了一个名字，叫作CRISPR，即成簇的、规 律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）。 在2005年，有3个生物信息学课题组报道称，这些 CRISPR序列里的空格 DNA总是能够与噬菌体的 DNA序列互补、匹配 美国马里兰州美国国家癌症生物技术信息中心的Eugene Koonin等人提出 了一个新想法，即细菌和古细菌能够吸收噬菌体的DNA，然后将其留作己 用，并转录出相应的RNA，与入侵的外源DNA结合，这有点类似于真核生 物采用的RNA干扰（RNA inte
10、rference, RNAi）机制。 Danisco公司的研究人员 Rodolphe Barrangou、Philippe Horvath等人在 2007年发现，他们只要对嗜热链球菌进行一番遗传学改造，插入或者去掉 几个与噬菌体序列互补的空格DNA片段，就可以改变细菌对噬菌体的免疫 力。发现历史Doudna和Emmanuelle Charpentier则分别把工作往前推进了一步,依赖 Cas9蛋白的CRISPR系统要比其它 CRISPR系统更简单。 Doudna和Charpentier的课题组都必须证明，他们能够非常精确地控制 Cas9蛋白的切割位点，确保不会发生脱靶的情况。 Doudna的博
11、士后Martin Jinek提出了将tracrRNA和空格 RNA组合起来， 形成一个所谓的“向导RNA分子（single-guide RNA）”的想法，并且他们 课题组已经在去年成功地构建出了好几个这种向导RNA，而且将其与 Cas9蛋白混合在一起，成功地对特定的DNA位点进行了切割（Science , 17 August 2012, p. 816）。十年前，科学家们开发出了锌指核酸酶（zinc finger nucleases），该蛋白拥有两个 人工组合在一起的结构域，它可以依靠其中的 DNA结合结构域（DNA-binding domains）结合到基因组中特定的位点上，然后再依靠其中的酶
12、切结构域将该位点 的DNA链切断。该技术诞生之后也掀起了一股热潮，甚至有人成立了公司，专门以 该技术为平台开发艾滋病治疗手段（Science , 23 December 2005，p. 1894）。锌指核酸酶最近又出现了另外一种基因组改造工具，那就是TALEN人工核酸酶 ，这是一种比锌指核酸酶更方便的基因组定向改造工具，并且有可能 会彻底取代锌指核酸酶（Science, 14 December 2012, p. 1408）。TALEN人工核酸酶CRISPR系统是以 RNA作为基因组定位工具，而锌指核酸酶和 TALEN核酸酶则都是以人工开发的特异性 DNA位点结合蛋白作为基 因组定位工具。 合成RNA要比合成蛋白质容易得多，用CRISPR技术只需要几个星 期就可以拿到确定的实验结果，可人工核酸酶技术至少需要好几个 月。”几者之间的区别
