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1、实验十二 离子交换柱层析法分离蛋白质 实验原理 1离子交换与洗脱 所谓离子交换，是指溶液中的某一种离子与另一种靠静电力结合在惰性载体上的离子进行可逆交换的过程，即溶液中的离子结合到载体上而载体上的离子被替换下来。若惰性载体上以共价键结合着带正电荷的活性基团，则可交换阴离子，叫阴离子交换剂；若以共价键结合着带负电荷的活性基团，则可交换阳离子，叫阳离子交换剂。在一定的条件下，混合物中不同蛋白质所带电荷的性质及电荷多少不同，有的能与特定离子交换剂结合，有的不能结合；能与离子交换剂结合的蛋白质中，结合力的大小也不一定相同，所以，采用适当的洗脱条件，可以对它们进行有效的分离。离子交换过程可以表示如下：
2、一R+Y一+x一一R+X一+Y一(阴离子交换) 一RY+x+一RX+Y+(阳离子交换) 上式中，代表惰性载体；R代表惰性载体上的活性基团；Y代表平衡离子(可替换离子)； x代表蛋白质分子。 样品进入离子交换柱之前，共价结合于惰性载体上的活性基团大部分处于溶剂化状态，并吸附着平衡缓冲液中带相反电荷的离子。蛋白质样品进入离子交换柱后，由于分子表面一些基团的电荷性质与交换剂上活性基团的电荷性质相反，因而会通过静电引力结合于交换剂上，并把其原来吸附的平衡离子取代下来。 蛋白质是两性电解质，它与离子交换剂的结合力取决于分子表面能够与离子交换剂形成静电键的数目，而后者首先与分子所携带的电荷的数目有关，其次
3、与蛋白质分子的大小及电荷排列也有一定关系，因为它们与蛋白质分子是否易于在离子交换剂上的适当部位形成静电键有关。总的来说，蛋白质分子与交换剂之间存在三种不同的结合状态：蛋白质分子与交换剂之间的静电键数目很多，以致它们同时解离的机率等于零。洗脱时，这部分蛋白质由于结合紧密而停留在柱顶端。蛋白质分子与交换剂之间的静电键数目相对较少，它们同时解离的机率达到某一有限值(01之间)。洗脱时，某一种蛋白质分子的静电键在某一时间里同时解离，随洗脱液向下移动。蛋白质分子与交换剂之间的静电键数目极少，完全不与交换剂结合。处于这种状态的蛋白质分子随洗脱液的前峰移动，呈现一个高而窄的“穿过峰(“不交换峰”)。如果混合
4、物中有几种蛋白质同时处于这种状态，那么它们会同时被洗脱下来，达不到分离目的。采用阳离子交换剂时，带负电荷的蛋白质分子不能结合而呈“穿过峰”洗脱下来。 蛋白质分子在离子交换剂上的结合状态是随着环境条件的变化而改变的。洗脱就是通过改变缓冲液离子强度或和pH来改变蛋白质与交换剂的结合状态，降低其与交换剂的结合力，使交换上去的不同蛋白质分子以不同速度洗脱下来，达到分离纯化的目的。增加缓冲液的离子强度时，由于洗脱液中高离子强度竞争性离子的存在，与交换剂结合的蛋白质分子被取代下来进入洗脱液中。洗脱液中离子种类不同时，取代能力不一样。改变缓冲液的pH时，蛋白质分子的解离度降低，电荷减少，从而减弱其与交换剂的
5、结合力。应用阴离子交换剂时要降低pH；应用阳离子交换剂时要升高pH。有时，同时改变两个方面的条件，有利于分离复杂的蛋白质混合物。在恒定的洗脱条件下，往往难以将复杂的蛋白质混合样品有效地分离。通常采用不断改变洗脱条件的方法，即用梯度洗脱的方法来分离蛋白质混合样品。 虽然离子交换层析法分离蛋白质时，主要通过离子交换的作用，但实际上也可能存在 一些疏水吸附和分子筛作用。 2离子交换剂 人工合成的离子交换剂由高分子的不溶性基质和许多与其共价结合的带电荷的活性基团组成。由于活性基团的电离性质不同，而有强酸性、强碱性、弱酸性和弱碱性之分。不溶性基质主要有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和硅胶等。
6、离子交换树脂一般只适合分离小分子物质如氨基酸等，不适合分离蛋白质等大分子物质，一方面是因为大分子不易进入树脂紧密交联结构的内部，另一方面是因为交联聚苯乙烯骨架疏水性很强，用于蛋白质分离时，会出现疏水性的不可逆吸附。此外，离子交换树脂的机械强度较差，而且树脂的体积常随着溶剂离子强度的变化发生溶胀和收缩。 离子交换纤维素的种类很多，可分为阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素两大类。由于这些材料是纤维状的，大部分活性基团分布在表面，所以，适合于分离蛋白质等生物大分子。二乙基氨乙基纤维素(DEAE一纤维素)和羧甲基纤维素(CM一纤维素)分别是应用得最广泛的阴离子交换纤维素和阳离子交换纤维素。另外，根据纤
7、维素颗粒的物理结构不同，可分为“纤维型，和“微晶型”两大类。微晶型”因颗粒细、比重大，能制成紧密的柱，交换容量大，分辨率高。 离子交换葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶具有许多优点：不会引起被分离物质的变性或失活；非特异性吸附很低；交换容量大(为离子交换纤维素的34倍)；容易制成微球型，因此装柱和层析时的流速都较易控制。它的缺点是随着洗脱液的离子强度和pH的变化，床体积变化大，明显影响流速；另外，由于它的凝胶性质，有时会把大分子物质排阻在网络结构之外。 目前，用于蛋白质和多肽离子交换HPLC的多为以硅胶为载体的离子交换剂。以硅胶为载体的离子交换剂的主要优点是有很好的机械强度，能耐受较高的层析柱压，可适
8、应广泛种类的流动相，在含有变性剂、有机溶剂和高离子强度的洗脱液中均能使用，不会发生明显的溶胀与收缩，而且可以制成各种孔径51 000 nm的刚性填料。根据硅胶载体上键合的活性基团的不同，可分为强酸性、强碱性、弱酸性和弱碱性的离子交换剂。通常用于蛋白质与多肽分离的强酸性阳离子交换剂联有磺酸基(一S03H)；强碱性阴离子交换剂联有季胺碱基一CH2N+(CH3)3；弱酸性阳离子交换剂联有羧甲基(一CH2一COO一，CM)；弱碱性阴离子交换剂联有二乙基氨乙基一CH2CH2N(CH2CH2)2，DEAE。强酸性和强碱性离子交换剂的优点是流动相较大范围内的pH不会改变载体活性基团的带电性质，因而在酸性、中
9、性和碱性的流动相中均能使用。弱酸性(CM型)的离子交换剂宜在pH40的环境中使用，弱碱性(DEAE型)的离子交换剂宜在pH8)，通常是使其带有正电荷而采用阳离子交换剂。等电点未知时，可参照电泳分析的结果。在中性和偏碱性条件下电泳时向阳极移动较快的物质，同样条件下可被阴离子交换剂吸附；向阴极移动或向阳极移动较慢的物质，同样条件下可被阳离子交换剂吸附。但有时有例外，因为某一物质的层析行为，除与分子的净电荷有关外，还与它的分子大小、分子结构和电荷排列等有关。对于等电点未知的蛋白质，还可用阴离子交换剂和阳离子交换剂分别在较高pH(如pH 86)和较低pH(如pH 55)条件下进行离子交换实验，观察交换
10、吸附的情况。如果待分离的物质能被两种交换剂吸附，则两种离子交换剂都可用于分离，而且待分离物质与其他成分分离的机会更多。如果都不吸附，则尽量降低样品和起始缓冲液的盐浓度，直至几乎为零。若发现被吸附的物质由于吸附太牢而不易洗脱，则应选用交换当量较小或具有弱解离活性基团的离子交换剂。 (2)缓冲液的选择缓冲液离子应不影响被分离物质的活性并不干扰其测定，不影响样品的溶解度和稳定性。如洗脱液要用280 nm波长检测时，缓冲液内就不能有芳香族化合物；如要用215225 nm波长检测肽键的含量，则不能用含羧基的缓冲液。采用阳离子交换剂时，应选用阴离子型缓冲液，如磷酸、醋酸缓冲液等。采用阴离子交换剂时，应选用
11、阳离子型缓冲液，如Tris、吡啶缓冲液等。 缓冲液pH的确定首先取决于被分离物质的等电点，采用阳离子交换剂时应低于物质的等电点，采用阴离子交换剂时应高于物质的等电点。同时要结合考虑被分离物质的溶解度、稳定性和离子交换剂的活性基团的PK。用阴离子交换剂时pH应低于其pK，用阳离子交换剂时pH应高于其pK，且应使缓冲液pH介于样品等电点和pK之间。 为了降低盐离子的竞争，起始缓冲液的浓度要尽可能的低(如001 molL左右)。这 就需要选用其pK接近所需pH的缓冲离子，以使缓冲液具有较强的缓冲能力，避免缓冲离子与离子交换剂作用而引起pH的改变。当确信样品易被吸附后，可适当提高起始缓冲液的浓度以保证
12、一定的缓冲能力。 实验材料与设备 1用品与仪器 玻璃层析柱(20 mL)，梯度混合器，核酸蛋白检测仪，记录仪，部分收集器，接收试管、天平，酸度计等。 2试剂 (1)蛋白质样品液：鸡卵清蛋白，pI=46；核糖核酸酶，pI=78；细胞色素c，pI=106； 胰岛素，pI=53。 (2)洗脱液A：005 molL TrisHCl缓冲液，pH：75；洗脱液B：005 molL TrisHCl缓冲液，pH=7.5，含有1.0mol/LNaCl. (3)DEAE一纤维素:05 molL HCl；05 molL NaOH；双蒸水。 实验操作程序 1离子交换剂的预处理 称取18 g DEAE一纤维素(DE52
13、，Whatman公司生产，6.3 mLg)置于小砂芯漏斗中.先在20mL 0.5 molLNaOH中浸泡30 min，然后用双蒸水洗至pH=8。再用20 mL0.5 molL HCl浸泡30 min，然后水洗至pH=40。最后用20 mL 05 molL NaOH浸泡30 min后水洗至pH=8.O。 2装柱 将玻璃层析柱洗净后垂直安装于支架上，装入约10 mL洗脱液A，打开下嘴阀让缓冲液慢慢滴出，同时，将悬浮于适量洗脱液A中的处理好的DEAE一纤维素一边搅动一边倒入层析柱中，让其自然沉降到全部加入为止。装柱时交换剂的悬浮液最好一次倒人，若分次倒入，则须在再次添加之前将界面处的交换剂搅起，以保
14、证柱床不分节。柱面要平整，柱中无气泡。待液面离纤维素沉降面约l cm后，关闭下嘴阀。 3平衡 连接梯度混合器，用起始缓冲液(洗脱液A)以10 mLmin的流速平衡柱子，直到流出液pH与起始缓冲液的完全相同为止。 4上样 揭开层析柱上盖。打开下嘴阀，待液面降至纤维素柱面时又关闭之。用滴管小心将05 mL样品均匀地加到纤维素柱面上，打开下嘴阀，待样品液面降至与柱面平齐时又关闭之。用同样的方法加入05 mL起始缓冲液，让其将残留于柱内壁的样品全部洗入纤维素柱后关闭下嘴阀。最后在柱面上覆盖一层起始缓冲液(约12 cm深)。 5洗脱 盖紧层析柱上盖，连接并打开梯度混合器，开始洗脱。梯度为30 min内由
15、100洗脱液A变到100洗脱液B。用核酸蛋白检测仪280 nm检测并用部分收集器收集流出的组分。根据离子交换层析的理论和记录仪上的洗脱曲线确定各蛋白质组分所在的接收试管。 讨 论 1配制离子交换层析的缓冲液时需要量最大的是水，对水的要求一般为去离子水。对于一些特殊用途的样品，如医药用的样品，则要求不含热原即各种内毒素的水，因而需要进一步纯化。通过全玻璃蒸馏器的双蒸水或三蒸水一般能达到要求。 2配制缓冲液时，应先配好缓冲离子的共轭酸和共轭碱溶液，然后按比例准确量取混合。用酸度计测量pH，必要时用共轭酸或共轭碱溶液调整之。配制好的缓冲液需经孔径为045m的滤膜过滤，并用超声波或氦气除去溶液中的气体。缓冲液应当新鲜配制，不用时放在4冰箱以防长菌，再用前须重新过滤和除气，但在冰箱中放置一周以上的缓冲液最好不用。 3加入的样品若为直接从生物材料中提取的混合物，也需过滤或高速离心，加样后要用足够的起始缓冲液流洗，使未吸附的物质全部洗出，并充分平衡层析柱，然后再用梯度洗脱。 4离子交换纤维素柱用起始缓冲液充分平衡后可再次使用。如长时间不用，须用01的叠氮钠缓冲液浸泡并于4冰箱存放。
