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1、生 物 技 术 通 报B I O T E C H N O L O G Y B U L L E T I N 综 述 与 专 论 2 0 0 6 年 第 4 期收 稿 日 期 : 2 0 0 6 - 0 6 - 0 9基 金 项 目 : 校 科 研 启 动 基 金 支 持作 者 简 介 : 卢 永 忠 ( 1 9 6 8 - ) , 男 , 副 教 授 , 理 学 博 士 , 研 究 方 向 : 分 子 生 物 学 与 基 因 工 程 , E - m a i l : l u y z y a h o o . c o m大 肠 杆 菌 蛋 白 酶 系 统 的 研 究 进 展卢 永 忠( 青 岛 科 技
2、 大 学 生 物 系 , 青 岛 2 6 6 0 4 2 )摘 要 : 基 因 工 程 菌 大 肠 杆 菌 细 胞 中 含 有 多 种 蛋 白 酶 , 具 有 重 要 的 生 理 功 能 , 同 时 也 是 影 响 外 源 蛋 白 表 达 水 平 的 重要 因 素 , 大 肠 杆 菌 蛋 白 酶 系 统 的 研 究 是 工 程 菌 改 良 的 基 础 。 为 减 少 蛋 白 酶 对 外 源 蛋 白 的 降 解 , 从 不 同 的 角 度 做 了 大 量 工 作 ,其 中 利 用 反 义 R N A 技 术 控 制 蛋 白 酶 活 性 是 一 条 值 得 探 索 的 思 路 。关 键 词 : 大
3、 肠 杆 菌 蛋 白 酶 重 组 蛋 白 质 反 义 R N A 技 术P r o g r e s s o n t h e R e s e a r c h o f E . c o l i P r o t e a s e S y s t e mL u Y o n g z h o n g( D e p a r t m e n t o f B i o t e c h n o l o g y , Q i n g d a o U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y , Q i n g d a o 2 6 6 0 4
4、2 )A b s t r a c t : T h e r e a r e m a n y k i n d s o f f u n c t i o n a l l y i m p o r t a n t p r o t e a s e s i n E . c o l i , w h i c h a l s o a r e t h e m a i n b a r r i e r s f o r h i g h e x p r e s -s i o n o f f o r e i g n p r o t e i n . R e s e a r c h o n E . c o l i p r o t
5、e a s e s y s t e m i s t h e b a s i s o f e n g i n e e r i n g s t r a i n i m p r o v e m e n t . I n o r d e r t o r e d u c e t h e i r n e g a -t i v e e f f e c t , m u c h h a s b e e n d o n e , a m o n g w h i c h a n t i s e n s e R N A t e c h n o l o g y i s w o r t h f u r t h e r t r
6、 y i n g .K e y w o r d s : E . c o l i P r o t e a s e R e c o m b i n a n t p r o t e i n A n t i s e n s e R N A t e c h n o l o g y大 肠 杆 菌 表 达 系 统 是 发 展 最 早 , 目 前 应 用 最 广泛 的 经 典 基 因 表 达 系 统 。 它 具 有 遗 传 背 景 清 楚 , 目标 基 因 表 达 水 平 高 , 培 养 周 期 短 , 抗 污 染 能 力 强 等优 点 , 是 制 备 重 组 蛋 白 的 重 要 宿 主 菌 1 。 许 多
7、具 有重 要 医 疗 功 能 和 经 济 价 值 的 蛋 白 产 物 都 是 通 过 大肠 杆 菌 获 得 表 达 2 。 但 该 系 统 也 有 一 个 不 足 之 处 , 即在 表 达 真 核 基 因 的 时 候 , 蛋 白 产 物 特 别 容 易 受 到 细胞 蛋 白 ( 水 解 ) 酶 的 降 解 , 多 肽 或 小 分 子 蛋 白 更 是 如此 , 严 重 影 响 目 标 产 物 的 表 达 水 平 1 , 3 。 尽 管 如 此 , 其作 为 基 因 表 达 宿 主 仍 具 有 不 可 替 代 的 作 用 4 。 完 善现 有 表 达 系 统 , 解 决 其 中 存 在 的 缺 陷
8、 从 而 更 好 地 发挥 作 用 一 直 是 大 肠 杆 菌 表 达 系 统 研 究 的 一 个 重 点 5 。 长 期 以 来 , 针 对 大 肠 杆 菌 的 蛋 白 酶 系 统 进 行 了 大量 研 究 , 并 取 得 了 重 要 进 展 。1 大 肠 杆 菌 中 蛋 白 酶 的 种 类 、 功 能 和 分 布研 究 发 现 , 在 大 肠 杆 菌 细 胞 中 存 在 多 种 蛋 白 酶( 表 1 ) 7 , 它 们 在 细 胞 代 谢 中 具 有 重 要 的 生 理 功 能 。一 方 面 , 可 通 过 对 调 节 蛋 白 的 灭 活 来 发 挥 调 节 作用 , 维 持 调 节 蛋
9、白 的 基 本 水 平 , 在 作 用 完 成 以 后 , 迅速 将 其 降 解 清 除 6 。 例 如 , H s l V U 与 L o n 参 与 细 胞 分裂 抑 制 蛋 白 S u l A 的 转 换 , 当 其 突 变 后 造 成 细 胞 内S u l A 水 平 升 高 , 从 而 抑 制 了 菌 体 的 生 长 。另 一 方 面 , 蛋 白 酶 还 作 为 大 肠 杆 菌 自 身 防 御 体系 的 组 成 部 分 , 参 与 降 解 无 用 的 , 错 误 合 成 或 折 叠的 蛋 白 质 。 这 些 蛋 白 质 大 多 不 具 有 生 物 学 功 能 , 甚至 对 细 胞 有
10、 害 。 如 H t r A ( D e g P ) 主 要 参 与 氧 化 损 伤 的膜 蛋 白 的 降 解 。 重 组 蛋 白 质 就 属 于 被 细 胞 认 为 是 无用 的 蛋 白 而 受 到 蛋 白 酶 的 攻 击 7 。蛋 白 酶 在 细 胞 内 的 分 布 有 各 自 特 定 的 区 域 , 细胞 质 是 含 量 最 高 的 区 域 ; 此 外 , 在 细 胞 膜 、 周 质 、 外膜 等 也 有 一 定 种 类 的 蛋 白 酶 分 布 。 不 同 区 域 的 蛋 白酶 具 有 不 同 的 表 达 调 控 机 制 8 。 研 究 表 明 , 许 多 应 急条 件 可 引 起 胞
11、内 蛋 白 酶 含 量 升 高 , 产 物 属 于 异 己 物质 , 并 可 能 对 宿 主 细 胞 产 生 毒 性 作 用 , 作 为 应 急 保护 性 反 应 , 细 胞 内 降 解 该 蛋 白 质 的 蛋 白 酶 产 量 会 迅速 增 加 , 并 可 在 短 时 间 内 达 到 高 峰 。 分 子 量 较 小 的2 0 0 6 年 第 4 期蛋 白 酶 底 物 A T P 位 置 类 型L o n ( L a ) S u l A , 较 大 异 常 蛋 白 +C l p A P ( T i , C l p ) 较 大 异 常 蛋 白 +C l p X P !O , s+H s l U V
12、 ( C l p Y Q ) 3 2, 较 大 异 常 蛋 白 +F aS o 氧 化 损 伤 的 蛋 白 -C i 1 5 K D -H f l AF t s H ( H f l B ) +M i 3 2, !C I I -T s p ( R e , P r c ) -H t r A ( D e g P , D o ) 氧 化 损 伤 的 蛋 白 -P i ( p r o t e a s e I I I ) 异 常 蛋 白 及 重 组 分 泌 蛋 白 -O m p T ( p r o t e a s e V I I ) 7 K D , -重 组 分 泌 蛋 白多 肽 碎 片 更 是 如 此
13、5 。 在 大 肠 杆 菌 中 , 这 些 应 急 因 素可 引 起 包 括 蛋 白 酶 在 内 的 2 0 多 种 热 休 克 蛋 白 的 表达 , 它 们 在 转 录 水 平 受 到 r p o H 基 因 产 物 3 2的 正 调控 , 这 些 基 因 的 表 达 都 伴 随 着 3 2水 平 和 活 力 的 升高 。 在 r p o H 基 因 缺 陷 株 , 异 源 蛋 白 不 诱 导 蛋 白 酶 表达 5 , 关 于 3 2与 细 胞 质 中 蛋 白 酶 表 达 之 间 的 关 系 已经 比 较 明 确 , 但 细 胞 如 何 将 异 常 蛋 白 这 一 信 号 传 递给 应 急
14、系 统 还 不 清 楚 。 而 应 急 条 件 引 起 的 周 质 等 部位 的 蛋 白 酶 表 达 主 要 与 E有 关 8 。2 蛋 白 酶 的 作 用 机 制蛋 白 酶 对 蛋 白 质 的 作 用 也 是 有 选 择 的 和 可 严格 调 控 的 。 细 胞 质 是 外 源 基 因 表 达 的 重 要 场 所 , 目标 蛋 白 在 细 胞 质 最 容 易 受 到 蛋 白 酶 的 作 用 。 大 肠 杆菌 细 胞 质 中 蛋 白 质 的 降 解 是 一 个 连 续 的 过 程 , 首 先由 5 种 能 量 依 赖 的 蛋 白 酶 ( L o n , C l p A P , C l p X
15、P ,H s l U V / C l p Y Q , F t s H ) 引 发 对 底 物 蛋 白 质 的 酶 解 , 这是 一 个 限 速 步 骤 , 要 求 严 格 的 底 物 专 一 性 ; 随 后 是非 能 量 依 赖 的 蛋 白 酶 和 多 肽 酶 对 所 产 生 的 肽 段 的降 解 7 。表 1 大 肠 杆 菌 的 蛋 白 酶能 量 依 赖 的 蛋 白 酶 的 降 解 作 用 是 很 重 要 的 , 可负 责 细 胞 质 9 0 % 以 上 的 蛋 白 的 降 解 , 尽 管 从 热 动 力学 角 度 看 , 能 量 是 非 必 需 的 , 因 为 通 常 降 解 是 自 发的
16、 过 程 , 而 且 L o n 和 C l p A P 等 在 降 解 小 肽 的 时 候 ,都 不 需 要 能 量 。 因 此 能 量 的 需 要 很 可 能 是 参 与 一 些特 殊 的 反 应 , 如 改 变 蛋 白 酶 的 构 象 , 打 开 底 物 , 或 将其 移 动 到 酶 的 活 性 位 。 对 蛋 白 酶 L o n 和 C l p 的 研 究最 为 深 入 , 它 们 的 含 量 尽 管 只 占 蛋 白 总 量 的 0 . 0 5 % 0 . 2 % , 但 却 负 责 胞 内 7 0 % 8 0 % 的 能 量 依 赖 的 蛋 白质 降 解 。对 于 分 泌 型 表 达 的 重 组 蛋 白 质 还 要 受 到 细 胞质 外 蛋 白 酶 如 H t r A ( D e g P ) 、 O m p T 及 P i 等 的 降 解作 用 7 。3 蛋 白 酶 活 性 控 制 的 途 径如 何 减 少 蛋 白 酶 对 目 标 蛋 白 的 降 解 一 直 是 基因 工 程
