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1、军团菌的分离培养与鉴定 福建省疾病预防控制中心 原灵 2009年6月3日军团菌革兰阴性杆菌,浅红色的短杆菌，直径 0.30.5m，长约1.25m或更长 ，菌体一端有鞭毛.在含L-半胱氨酸和焦磷酸铁的BCYE琼脂培养基上生长，通常需要在37 5%CO2培养箱培养2-10天。生长形成的菌落一般呈白色，也可能 会从紫色变为蓝色，或是灰绿色。初步在BCYE琼脂培养基上生长的菌落为刻 花玻璃样，具有多型性.军团菌军团菌军团菌电镜图片军团菌科、属、种、血清型u军团菌科 (Legionellaceae ）Legionella / Fluoribacter bozemanii / Tatlockia micd
2、adei u军团菌属：16s rRNA分析表明，在蛋白细菌系亚群中， 军团菌科只有一个军团菌亚群。与引起Q热病的coxiella burneti(贝氏克斯体）亲缘关系最近，二者具有同样的细 胞内生活方式，可以利用共同的基因感染宿主细胞。u军团菌种：现已发现50个种（species），70多个血清型 （serogroups)，至少有20个种可引起人感染。种名发现时间 种名发现时间 种名发现时间 Legionella pneumophila1979Legionella maceachernii 1985Legionella geestiana 1993Legionella bozemanae 19
3、80Legionella parisiensis 1985Legionella londiniensis 1993Legionella dumoffii 1980Legionella rubrilucens 1985Legionella nautarum 1993Legionella gormanii 1980Legionella santicrucis 1985Legionella quateirensis 1993Legionella micdadei 1980Legionella spiritensis 1985Legionella worsleiensis 1993Legionella
4、 pittsburghensis 1980Legionella steigerwaltii 1985Legionella lansingensis 1994Legionella jordanis 1982Legionella israelensis 1986Legionella lytica 1996Legionella longbeachae 1982Legionella birminghamensis1988Legionella waltersii 1996Legionella oakridgensis 1983Legionella brunensis 1989Legionella tau
5、rinensis 1999Legionella wadsworthii 1983Legionella cincinnatiensis1989Legionella beliardensis 2001Legionella feeleii 1984Legionella moravica 1989Legionella drozanskii 2001Legionella sainthelensi 1984Legionella quinlivanii 1990Legionella fallonii 2001Legionella anisa 1985Legionella tucsonensis 1990Le
6、gionella gresilensis 2001Legionella cherrii 1985Legionella adelaidensis 1991Legionella rowbothamii 2001Legionella erythra 1985Legionella fairfieldensis 1991Legionella busanensis 2003Legionella hackeliae 1985Legionella gratiana 1991Legionella drancourtii 2004Legionella jamestowniensis1985Legionella s
7、hakespearei 1992军团菌种SpeciesNo. of serogroupsNo. associated with disease 1. L. pneumophila1515 2. L. bozemanii22 3. L. dumoffii11 4. L. micdadei11 5. L. longbeachae22 6. L. jordanis11 7. L. wadsworthii11 8. L. hackeliae22 9. L. feeleii22 10. L. maceachernii11 11. L. birminghamensis11 12. L. cincinnat
8、iensis11 13. L. gormanii11 14. L. sainthelensi22 15. L. tucsonensis11 16. L. anisa11 17. L. lansingensis11 18. L. erythra21 19. L. parisiensis11 20. L. oakridgensis1120 个 种 的 军 团 菌 可 引 起 人 疾 病军团菌操作生物安全性u应用的试剂须符合有毒物质操作要求和相关规定。u生物安全级实验室，最好在安全柜中操作。u操作人员培训。u菌种保存。可感染人类的高致病性病原微生物菌（ 毒）种或样本运输管理规定病原菌名称危害程度 分
9、类实验活动所需生物安全实验室级别运输包装分类学名中文名大量活菌 操作动物感 染实验样本 检测非感染性 材料实验A/BUN 编 号Legionella pneumophila嗜肺军团 菌第三类BSL-2ABSL-2BSL-2BSL-1BUN 3373样本的采集和运输（一）标本的种类 （二）标本的运输和相关生物安全要求标本的种类u 环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋浴水, 加湿器水； u 病人组织标本:如痰,支气管灌洗液,胸水,血液等标本。 u 1983年新疆从一瘫患羔羊后肢中分离到军团菌。标本的运输和相关生物安全要求u在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻,但要防止受热 和阳光,标本要
10、尽可能快或最好在两天内送到实验室,室温 下(21+3)贮藏在实验室或其他地方。u对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行， 应放在-20冻存备用。水样标本中军团菌的分离方法检测依据: 1 、ISO-11731水质军团菌检测2 、 公共场所集中空调通风系统 卫生规范中的集中空调通风系统冷却水、冷凝 水中嗜肺军团菌的检验方法见附录A。 适用于各种环境标本军团菌检测 ，包括： 饮用 水、工业用水、天然水以及一些如沉积物、沉淀 物、软泥等物质。军团菌水质检测概括1.采样 2.浓缩 3.培养 4.分离 5.鉴定军团菌检测所需准备基本试剂1.培养基（GVPC，BCYE,BCYE-CYS)2.试剂
11、(生化试剂、甲醛的盐溶液）3.酸缓冲液（0.2mol/L KCL-HCL)，碱缓冲液（ 0.03mol/L KOH）4.血清学试剂标本浓缩所需准备仪器设备u 过滤 滤器及漏斗，过滤装置需能够承受高压。 正压膜蠕动过滤泵，能够控制流速。 尼龙或聚碳酸酯滤膜 硅胶管 u 离心机离心力能够达到（6000100）g,要有安全盖。u 漩涡振荡器转速至少能够达到（2005）r/min。培养检测所需准备材料1.直径大约为90mm或100mm的无菌培养皿2.培养箱，CO2能够恒温保持在（361）。3.水浴箱，能够保持在（501）4.显微镜或荧光显微镜。样品采样准备材料1. 玻璃、聚乙烯或类似的容器瓶：灭菌处理
12、。水样一般采 集为250-500ml，收集在容器瓶中。2. 如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高压，可用流动的 热水（不低于70）或蒸汽进行巴斯德氏消毒，时间不低 于5分钟。3. 小的无菌容器瓶：可用来收集淤泥、沉淀物或沉积物。4. 广口的容器：用来收集淤泥等，要有螺丝盖。5. 灭菌棉拭子。一般建议用塑料包装的容器采样后样品处理 方法与步骤 样品处理 1. 沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或 1000r/min离心1min去除。 2. 过滤：将经沉淀或离心的样品通过孔径0.22 0.45m滤膜过滤，取下滤膜置于15ml灭菌水中 ，充分洗脱，备用。 3.热处理：取1ml洗脱样品置50水浴加热30mi
13、n 。 4.酸处理：取5ml洗脱样品，调pH至2.2，轻轻摇 匀，放置5min。ISO-11731水质军团菌检测浓缩标本酸处理酸缓冲液：仔细地量取17.4ml浓盐酸加到1L蒸馏水中，配成 0.2mol/L的盐酸缓冲液；称14.9gKCl加到1L蒸馏水中，配 成0.2mol/L的KCl溶液。将3.9ml 0.2mol/L的盐酸溶液和 25ml 0.2mol/L的KCl溶液混合，用1mol/L的KOH溶液调pH至 2.20.2，装在一个带塞的玻璃瓶内，于室温暗处贮存， 不要超过1个月。1.将110ml样品（浓缩或未浓缩的）放入带有螺旋帽的 容器中，再将其6000g离心10min或3000g离心30
14、min。2.用无菌吸管吸取上清，使体积变为原来的一半。用振荡 器或用力混合，使沉淀重悬。3.加入酸缓冲液使体积和原来相同,并轻晃摇匀静置5min。样品浓缩离心过滤接种酸处理 热处理水样的正压膜过滤法1. 安放滤膜；2. 过滤；3. 取膜；4. 洗膜。水样的离心1.将200ml左右样品倒入容积为300500ml的无菌离心瓶 中；2.6000g离心10min，或者3000g离心30min，离心温度在15 25之间；3.无菌操作去除上清；4.用520ml溶液或无菌蒸馏水将沉淀重悬。水样浓缩物的贮存1.最好对样品立刻进行分析；2.标本于（62）储藏最多不超过14天。对于军团菌来说，如果储藏于06，这种损失是最明显的。而且，温度在20或20以上时，异养生物的 生长速度就会变快。 浓缩标本热处理1.向无菌容器中放入（10.5）ml（浓缩或未浓缩）的 标本。2.在（501）水浴中放置（302）min。军团菌培养基Muller-Hinton琼脂第一次分离出嗜肺军团菌使用的培养基活性炭酵母抽提物琼脂，活性炭替代培 了淀粉以去除培养基的毒性，并且氨基 酸也逐渐被酵母抽提物替代CYE琼脂CYE琼脂加入-酮戊二酸BCYE琼脂BCYE琼脂中含有选择性抗生素GVPC琼脂军团菌培养基1. 酵母浸出物（细菌级） 10.0g2. 琼脂 12.0g3. 活性炭
