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1、*ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA 解旋解链合成引物子链延长DNA的体内复制基本过程ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA 解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶DNA的体内复制基本过程ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA 解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCA
2、TCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA 聚合酶DNA 聚合酶DNA的体内复制基本过程1985年，美国PE-Cetus公司的 Mullis等人发明了聚合酶链反应 （PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内 的DNA复制最初采用E.coliDNA聚合酶进行 PCR，由于该酶不耐热，使这一过 程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能 高效率的进行，随后PE-Cetus公 司推出了第一台PCR自动化热循环 仪KaryKary B. Mullis B. Mullisof the Polymerase Chain Reaction1989 1989年美国年美国Sc
3、ienceScience杂志列杂志列PCR PCR 为十为十 余项重大科学发明之首余项重大科学发明之首, ,比喻比喻19891989年为年为PCRPCR爆爆 炸年炸年, ,穆利斯荣获穆利斯荣获19931993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。引物引物MullisMullis 的构思的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段TaqTaq DNADNA聚合酶（聚合酶（ThermusThermus aquaticusaquaticus) )酶活性酶活性(%)(%)温度温度()40 50 60 70 80 90 100100806040207272949455
4、55PCRPCR循环循环一、PCR的基本原理u类似于DNA的体内复制。u首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混 合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶 序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合 酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程 就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循 环的不断重复。PCR技术原理和基本操作TaqTaqP1P1P2P2PCRPCR反应体系反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 反应缓冲液 辅助因子：Mg2+标准的PCR反应体系：10扩增缓冲液 10ul4种
5、dNTP混合物 各 200umol/L 800ul 引物 各 10100pmol模板DNA 0.1 2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100uluPCR技术的反应条件Denature template DNA by heat (95 oC)Target SequenceTarget Sequence模板DNA的变性：模板DNA经加热至95左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备；PCR Cycle - Step 1 PCR Cycle - Step 2 Temp
6、erature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链 后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporate
7、dTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 25355353Taq DNA Polymerase引物的延伸： DNA模板-引物 结合物在Taq DNA聚合酶的 作用下，以 dNTPs为反应原 料，靶序列为模 板，按碱基配对 与半保留复制原 理，合成一条新 的与模板DNA 互补 链。3End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence每完成一 个循环需24 分钟， 23小时就能将待 扩目的基因扩 增放大几百万
8、倍。Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon*181 缓冲液10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，pH=8.3-9.0(室
9、温 时约为7.2)，还可有添加剂、共溶剂等。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性 丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。二、有关PCR反应体系常 识2、脱氧三磷酸核苷(dNTPs)dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。 3、引物使用浓度为0.1-0.5 mol/L。浓度过低则产量低，过高则 易导致错配。*194、模板单、双链DNA均可。一个PCR反应中104至107个模板分子可 获得较理想的效果，但由于PCR较灵敏，更少的模板分子数在 循环数增加时也会得到大量扩增。不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类，模板纯度
10、不高往往是限制 PCR扩增的重要因素。 5、耐热性的DNA聚合酶有多种，均从耐热性的细菌中分离出来，均耐高温，普遍 具有53聚合酶和53外切酶活性。常用的有：1）Taq DNA聚合酶 2）Tth DNA聚合酶 3）Vent DNA聚合酶 4） Pwo DNA聚合酶 5）Pfu DNA聚合酶 6）混合DNA聚合酶。*20PCR引物的设计一般原则引物长度一般以1830bp为宜，过短降低特异性，过长会引 起退火时结合的模板数减少，降低反应效率。解链温度(Tm值)很重要，直接决定了扩增中可使用的退火温 度(Ta值)的高低，两条引物间的Tm值越接近越好。避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结
11、构 。引物3端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任 何修饰，也不能形成二级结构的可能。要避免两个引物间碱基序列互补以及同一引物自身碱基序列 互补。引物5末端碱基可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内 切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克 隆和表达。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物与核酸序列 数据库的其它序列均应无明显同源性，以免造成不必要的非 特异性扩增。 *21三、三、PCRPCR反应程序反应程序1、常规程序：94左右预变性几十秒至几分钟；94左右变性10秒至1分钟；50-65左右退火30秒至1分钟； 20-35个循环72左右延伸30秒至几分钟；72左右
12、最后延伸和加尾3-10分钟；4-25保持3分钟或更长。 2、退火和延伸温度： 退火温度Ta值由Tm值决定，多数情况下Ta采用Tm减去3-5 ，较高时特异性强但退火效率低，较低时退火效率增加而非 特异扩增增加，可根据实际研究目的采用高特异性或低特异 性退火。*223、反应时间：变性步骤一般为5秒至1分钟，变性温度高时时间短，低时时 间长，简单模板时间短，复杂模板时间长。退火时间一般为30秒至1分钟即可，引物结构好的时间短， 引物结构差的退火时间宜长。延伸时间从半分钟到10分钟以上不等，由扩增片段的长度和 DNA聚合酶的延伸速度共同决定。4、循环次数：多数为25-35，主要取决于模板属性、模板丰度
13、、引物退火 效率DNA聚合酶的扩增能力。裸露DNA、杂质少、高丰度模板、 引物结构好、DNA聚合酶扩增能力强时，循环数宜少，以尽量减 少突变。否则宜多，以保证获得必要的PCR产物量。1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3 高温变性1 低温退火2 重复13步 2530轮目的DNA片段 扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链 与引物复性DNA变性 形成2条单链子链延伸 DNA加倍模板DNA95PCR的基本原理uPCR反应条件uPCR过程uPCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理uPCR反应条件uPCR过程uPCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶P
14、CR的基本原理uPCR反应条件uPCR过程uPCR的特点72第1轮结束 第2轮开始PCR的基本原理uPCR反应条件uPCR过程uPCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理uPCR反应条件uPCR过程uPCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理uPCR反应条件uPCR过程uPCR的特点 重复30轮后 230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增 第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn 循环次数实际拷贝数=(1+x)nX 平均效率,约为0.85n 循环次数PCR的特点灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水
15、平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组 织的粗提DNAPCR操作（录像）PCR中其它注意的事项1.防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管(离心管)一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 2.设立对照： 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板、无模板 试剂对照： 除模板外的所有组分PCR应用举例1、在PCR产物两端添加限制性酶切位点u在PCR引物的5加上根据需要而设计的酶切位点， PCR产物内部无该切点。u在酶切位点的5加3个左右的保护碱基，其数目多 少取决该酶的性质。uPCR产物经电泳回收后，直接用限制酶进行切割， 纯化后与目标载体连接重组。u该法适用于直接将PCR产物克隆到表达载体进行功 能研究，但构建好的表达载体必须测序才能证明 PCR产物的身份正确且没有突变。*352、TA克隆这是目前最通行的PCR产物克隆方法，基本思 路是先将PCR产物与特制的T载体进行连接重组，测 序证明正确无误后，再从T载体上亚克隆到表达载 体上进行功能研究。Taq酶PCR产物的特点：该酶具有末端转移酶活 性，通常
