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1、内科学内科学( (心血管病心血管病) )专业优秀论文专业优秀论文 调节调节 RAGERAGE 表达促进内皮祖细胞衰表达促进内皮祖细胞衰老的实验研究老的实验研究关键词：内皮祖细胞关键词：内皮祖细胞 晚期糖基化终末产物受体晚期糖基化终末产物受体 晚期糖基化终末产物晚期糖基化终末产物 氧化应激氧化应激 动脉粥样硬化动脉粥样硬化 C C 反应蛋白反应蛋白 细胞培养细胞培养 动物模型动物模型摘要：动脉粥样硬化是动脉的一种炎性、退行性和增生性病变，其病理生理基 础在于血管损伤后新生内膜过度增殖及内皮功能不全。EPCs 是一类能增殖并分 化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体
2、细胞。EPCs 不仅参与血管形成(angiogenesis)，同时也参与出生后血管生成 (vasculogenesis)和损伤血管内皮功能的修复，在防治动脉粥样硬化发生发展 过程中扮演重要角色。骨髓 EPC 虽属于早期细胞，其功能和潜质仍不可避免的 受到遗传和机体环境的影响，会出现细胞衰老的表现1、2，不仅修复损伤血 管内膜防治动脉粥样硬化的能力下降，甚至会导致血管损伤后新生内膜过度增 殖，内皮功能紊乱，促使动脉粥样硬化的发生发展3，4。了解影响 EPCs 衰老 因素，明确其影响 EPCs 活性途径，提高 EPCs 功能活性，对防治动脉粥样硬化 将产生积极的影响。 晚期糖基化终末产物(adva
3、nced glycation end products，AGEs)是蛋白质、脂质或核酸等大分子与葡萄糖或其它还原单糖通过 非酶糖基化反应生成的稳定的共价化合物。血清 AGEs 水平在高龄、动脉粥样硬 化、糖尿病患者中显著升5、6。血清 AGEs 浓度可作为机体衰老和动脉粥样硬 化早期预测的生物学标志7-10。AGEs 与内皮细胞表面的 RAGE 结合能促进氧 化应激，激活 NF-KB，增加血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、组织因子的表达， 增加内皮细胞的渗透性，减少一氧化氮(NO)合成，促进单核细胞的黏附和经内 皮的迁移，提高促凝活性，促进脂质的浸润11-14，这些在动脉粥样硬化的发 生、
4、发展中起到重要作用。在我们既往的研究中发现老龄大鼠的血清可以抑制 年轻供体大鼠骨髓 EPCs 的活性，而使用年轻供体大鼠的血清则可以提高老龄供 体大鼠骨髓 EPCs 活性，说明老龄大鼠血清中某些成分可以抑制 EPCs 功能。我 们也发现动脉粥样硬化会导致 EPCs 数量减少、活性减退，且与动脉粥样硬化程 度正相关15，认为某些和动脉粥样硬化相关的物质可能影响 EPCs 功能导致 EPCs 衰老。Dernbach 等16发现 EPCs 相对于内皮细胞(EC)具有更低的 ROS 水 平，EPCs 修复损伤血管的能力与其较低的 ROS 水平有关，ROS 水平升高，EPCs 修复损伤血管的活性降低。基
5、于以上研究我们设想 AGEs 通过 RAGE 调节细胞内 氧化应激影响 EPCs 衰老，参与动脉粥样硬化发生发展过程。 本实验拟使用 使用 AGEs 交联阻断剂 ALT711 治疗，观察 ALT711 治疗对不同年龄大鼠骨髓 EPCs 功能的影响；体外培养骨髓 EPCs，验证 AGEs 对 EPCs 生物学功能的影响； 调节 EPCs 表面 RAGE 的表达，研究 RAGE 表达改变对 EPICs 衰老的影响。 方 法： 1、使用 AGEs 交联阻断剂 ALT711 治疗，观察 ALT711 治疗对不同年龄大 鼠骨髓 EPCs 功能的影响：3-4 月龄、10-12 月龄、18-20 月龄 SD
6、 雄性大鼠，随 机分为 ALT711 喂养组和对照组，从骨髓获取单个核细胞并进行体外培养、分化。 培养 7d 后检测各组 EPCs 迁移、黏附、增殖能力。提取不同年龄段大鼠血清， 分为 ALT711 干预组和对照组培养年轻大鼠骨髓 EPCs，培养 7d 后检测培养的各 组 EPCs 迁移、黏附、增殖能力。探讨供体年龄因素对骨髓内皮祖细胞功能的影 响及 ALT711 对高龄供体骨髓 EPCs 的活化作用。 2、观察不同浓度 AGEs 对EPCs 活性的影响：3-4 月龄 SD 雄性大鼠，从骨髓获取单个核细胞并进行体外培 养、分化。培养 7d 后在 EPCs 中加入不同浓度 AGEs，测定 AGE
7、s 作用 24h 后 EPCs 内活性氧、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量， 同时测定 EPCs 迁移、黏附、增殖能力。探讨 AGEs 对骨髓 EPCs 活性的影响。 3、观察 CRP 对 EPCs 活性的影响：3-4 月龄 SD 雄性大鼠，从骨髓获取单个核细 胞并进行体外培养、分化。培养 7d 后在 EPCs 中加入不同浓度 CRP，测定 CRP 作用不同时间后 EPCs 迁移、黏附、增殖能力。探讨 CRP 对骨髓 EPCs 活性的影 响。 4、研究 RAGE 介导的氧化应激对 EPCs 功能的影响及在 EPCs 衰老中的作 用：使用不同浓度 CRP 刺激 E
8、PCs，检测 CRP 对 RAGE 的上调作用和对 AGEs 与 RAGE 结合的协同促进效应；使用脂质体 2000 转染 siRNA 到 EPCs，检测 siRNA 对 RAGE 的下调作用；检测不同 RAGE 表达状态下 EPCs 内氧化应激强弱；使用 半乳糖酐酶染色检测 EPCs 衰老状态。 5、研究阻断 RAGE 表达对颈动脉损 伤模型的修复作用：建立颈动脉损伤大鼠切脾模型并随机分为对照组、高表达 RAGE 移植组和阻断 RAGE 表达组进行细胞移植，于细胞移植后 14d，检测各族颈 动脉内膜/中膜比、血管张力。 结果： 1、分离所得的单个核细胞初为圆 形，培养 3-5 天后可观察到少
9、量梭形贴壁细胞，7-10 天后出现大量梭形细胞， 并可观察到梭形细胞首尾相连形成条索状结构。用 DiI-acLDL 及 FITC-UEA-I 对 细胞染色后，通过荧光显微镜观察，染色双阳性细胞(黄色)为正在分化的 EPCs。vWF 免疫组化染色阳性细胞呈棕黄色； 2、将不同年龄组培养 EPCs 进 行迁移、黏附及增殖功能分析，结果提示随供体年龄的增长，骨髓内皮祖细胞 迁移、黏附、增殖等功能减退(Plt;0.01)，ALT711 治疗可部分恢复年龄 相关骨髓 EPCs 活性；随大鼠年龄增加其血清对骨髓 EPCs 活性具有抑制作用， 加入 ALT711 干预可以拮抗这种效应。 3、AGEs 作用后
10、 EPCs 内活性氧含量明 显增加，超氧化物岐化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶含量减少，EPCs 生 物学功能明显减退(Plt;0.01)。并且这种变化与 AGEs 浓度成正相关 (Plt;0.01)。 4、C 反应蛋白作用后骨髓 EPCs 迁移、黏附和增殖能力 明显减退。并且 C 反应蛋白的这种作用成时间和浓度依赖性，随作用时间延长 和/或浓度增加，EPCs 功能明显减退(Plt;0.01)。 5、使用不同浓度 CRP 刺激 EPCs 可以上调 EPCs 表面 RAGE 的表达，增强 AGEs 与 RAGE 结合，增强 EPCs 内氧化应激，促进 EPCs 衰老(Plt;0.01)。使用脂
11、质体 2000 转染 siRNA 阻断 RAGE 可以削弱上诉作用(Plt;0.01)。 6、不同细胞移植对 大鼠颈动脉修复有明显差异，低 RAGE 表达组修复颈动脉损伤程度明显优于高 RAGE 表达组(Plt;0.01)。 结论： 1、供体年龄对骨髓 EPCs 有影响， 随供体年龄增长骨髓 EPCs 迁移、黏附、增殖等功能减退。ALT711 干预可以改 善供体增龄导致的 EPCs 活性减退，拮抗老年供体血清对 EPCs 活性的负性调节 效应； 2、AGEs 促进 EPCs 内活性氧生成，减少抗氧化酶的合成，增强氧化 应激，破坏细胞内环境稳定性，使细胞生物学功能受损，并且这种变化与 AGEs
12、浓度成正相关； 3、CRP 对骨髓 EPCs 活性有影响，随 CRP 浓度和作用时间增 加骨髓 EPCs 迁移、黏附、增殖等功能受损； 4、CRP 成浓度依赖性调节 EPCs 内 RAGE 表达，增强 AGEs 的作用； 5、RAGE 表达改变可影响 EPCs 内氧化应 激，改变骨髓 EPCs 功能，促进 EPCs 衰老。低表达 RAGE 的 EPCs 修复损伤内膜 恢复血管功能的能力明显优于高表达 RAGE 的 EPCs。正文内容正文内容动脉粥样硬化是动脉的一种炎性、退行性和增生性病变，其病理生理基础 在于血管损伤后新生内膜过度增殖及内皮功能不全。EPCs 是一类能增殖并分化 为血管内皮细胞
13、，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细 胞。EPCs 不仅参与血管形成(angiogenesis)，同时也参与出生后血管生成 (vasculogenesis)和损伤血管内皮功能的修复，在防治动脉粥样硬化发生发展 过程中扮演重要角色。骨髓 EPC 虽属于早期细胞，其功能和潜质仍不可避免的 受到遗传和机体环境的影响，会出现细胞衰老的表现1、2，不仅修复损伤血 管内膜防治动脉粥样硬化的能力下降，甚至会导致血管损伤后新生内膜过度增 殖，内皮功能紊乱，促使动脉粥样硬化的发生发展3，4。了解影响 EPCs 衰老 因素，明确其影响 EPCs 活性途径，提高 EPCs 功能活性，对防治动脉粥样
14、硬化 将产生积极的影响。 晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)是蛋白质、脂质或核酸等大分子与葡萄糖或其它还原单糖通过 非酶糖基化反应生成的稳定的共价化合物。血清 AGEs 水平在高龄、动脉粥样硬 化、糖尿病患者中显著升5、6。血清 AGEs 浓度可作为机体衰老和动脉粥样硬 化早期预测的生物学标志7-10。AGEs 与内皮细胞表面的 RAGE 结合能促进氧 化应激，激活 NF-KB，增加血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、组织因子的表达， 增加内皮细胞的渗透性，减少一氧化氮(NO)合成，促进单核细胞的黏附和经内 皮的迁移，提高促凝活性，
15、促进脂质的浸润11-14，这些在动脉粥样硬化的发 生、发展中起到重要作用。在我们既往的研究中发现老龄大鼠的血清可以抑制 年轻供体大鼠骨髓 EPCs 的活性，而使用年轻供体大鼠的血清则可以提高老龄供 体大鼠骨髓 EPCs 活性，说明老龄大鼠血清中某些成分可以抑制 EPCs 功能。我 们也发现动脉粥样硬化会导致 EPCs 数量减少、活性减退，且与动脉粥样硬化程 度正相关15，认为某些和动脉粥样硬化相关的物质可能影响 EPCs 功能导致 EPCs 衰老。Dernbach 等16发现 EPCs 相对于内皮细胞(EC)具有更低的 ROS 水 平，EPCs 修复损伤血管的能力与其较低的 ROS 水平有关，
16、ROS 水平升高，EPCs 修复损伤血管的活性降低。基于以上研究我们设想 AGEs 通过 RAGE 调节细胞内 氧化应激影响 EPCs 衰老，参与动脉粥样硬化发生发展过程。 本实验拟使用 使用 AGEs 交联阻断剂 ALT711 治疗，观察 ALT711 治疗对不同年龄大鼠骨髓 EPCs 功能的影响；体外培养骨髓 EPCs，验证 AGEs 对 EPCs 生物学功能的影响； 调节 EPCs 表面 RAGE 的表达，研究 RAGE 表达改变对 EPICs 衰老的影响。 方 法： 1、使用 AGEs 交联阻断剂 ALT711 治疗，观察 ALT711 治疗对不同年龄大 鼠骨髓 EPCs 功能的影响：3-4 月龄、10-12 月龄、18-20 月龄 SD 雄性大鼠，随 机分为 ALT711 喂养组和对照组，从骨髓获取单个核细胞并进行体外培养、分化。 培养 7d 后检测各组 EPCs 迁移、黏附、增殖能力。提取
