核酸分离纯化技术

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1、基因诊断技术基因诊断(gene diagnosis)是利用分子生物学及 分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析基因的存 在、鉴定疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突 变，以诊断各种感染性疾病和遗传性疾病，进行肿 瘤分子水平的研究。主要技术及过程区分或鉴定DNA的异常分离、扩增待测的DNA片断基因探针的制备和标记n基因诊断的特点:n高度的特异性n高度的灵敏性n实现早期快速诊断n被检测基因不一定活化，可检测表达差异基因 。n基本技术：n（一）核酸分子杂交n（二）聚合酶链反应（PCR）n（三）单链构象多态性检测n（四）限制酶酶谱分析n（五）DNA序列测定n（六）DNA芯片技术第一节 核酸的分离与纯化

2、n意义：实验的第一步工作，实验结果的基本保障n原则：n保证一级结构的完整性n排除其它大分子的污染要求：1.不能存在对核酸结构功能有影响的物质2.降低蛋白、多糖、脂类分子污染一、首先了解核酸的存在状态及分布：形状：真核生物染色 体DNA是双链线状 ，其细胞器DNA以 及原核生物DNA， 质粒DNA等都是双 链环状。 多数生物体的RNA分子是单链线状。而 且，不同类型的RNA还有不同的结构特 点。如真核生物mRNA多数有PolyA尾 巴。至于病毒、类病毒所含的DNA和 RNA分子则形式多样，有双链线状、双 链环状、单链线状、单链环状等。无论 DNA还是RNA，在体内都形成一定的高 级结构。 分布：

3、真核生物的DNA主要存在于细胞核中，只有 约5%在线粒体、叶绿体等细胞器中。RNA 则75%左右存在于细胞质中，约15%在细 胞器中，约10%在核中。原核生物DNA集 中在核质区，RNA分散在细胞质里。细胞质 各种RNA中，以rRNA的数量最多（约占 5%），tRNA其次（15-20%）， mRNA最少（1-5%）。油菜叶片总油菜叶片总RNARNA的非变性电泳（的非变性电泳（ A A ）和甲醛变性电泳（）和甲醛变性电泳（ B B ）结果）结果二分离纯化核酸时的注意事项要得到具有生物活性的核酸大分子， 在分离时必须避免核酸变性，并尽可能保 持分子的完整性，避免降解。因此，要注 意下列事项：.尽量

4、简化操作步骤，缩短提取过程，以 减少变性降解的机会。n.减少化学因素对核酸的降解，避免酸碱对核酸的磷酸二脂键的破 坏3, 5-磷酸二酯键温度： 最适温度 防止机械剪切力的作用：基因组DNA：分子细长，容易受到机械剪 切力的作用而断裂，所以机械剪切作用是分离 DNA时的主要危险。.减少物理因素对核酸的降解操作时动作必须轻缓，搅拌时 要温和，避免让DNA溶液通过狭窄 的孔道。在提取缓冲液中加入蔗糖或 山梨糖醇等增加溶液的渗透 压。提取分子量较小，结构又很 紧密的DNA，如小的细菌 质粒超螺旋DNA等时，机 械剪切力的威胁较小，操作 时可不必过于谨慎核酸酶直接破坏核酸一级结构，必须抑制其活 性对于D

5、NA酶：大多数DNA酶作用时需要二价金属离子，如 Ca2+, Mg2+等。因此只要加入EDTA（乙二 胺四乙酸），螯合剂就可以基本上抑制DNA酶 的活力。.防止核酸的生物降解无所不在的RNA酶：外源性RNA酶：RNA制备过程中用到的玻璃和塑料制 品、研究人员本身尤其是研究人员的手，以及分离过程 中用到的试剂和溶液。内源性RNA酶：组织本身所固有的，在某些组织中（如 胰腺），或者在其特定的生理状态（如快速发育期间） 下的含量很高。而且一当细胞破碎后即释放出来。对于RNA酶：其具有高稳定性，抗酸抗碱，具很广的pH作用范围， 抗高温严寒（065均具有活性）。而该酶作用时不 需要二价金属离子，故用螯合

6、剂无法抑制其活力。三核酸的分离提取大致步骤：. .收集细胞收集细胞.破碎裂解细胞（或细胞器裂解细胞（或细胞器 ）.解聚核蛋白并去除蛋白质解聚核蛋白并去除蛋白质. .沉淀核酸并去除其他杂质（纯化）。沉淀核酸并去除其他杂质（纯化）。（一）破碎细胞1机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力的作用使 细胞破碎的方法，称为机械破碎法。 2物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使 组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法 多用于微生物细胞的破碎。常用的物理破碎方法有：温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞由于热 胀 冷缩的作用而破碎。该法简单易行，但效率不高，需反复几次才能达到 预期的效果。

7、 压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压及渗透压变化等方法 。如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。超声波法：超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手段，且一次处理的量较大。该方法的主要缺陷是超 声空穴局部过热引起的生物大分子的变性，所以超声 振荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理，尽量减小热效应引起的酶的失活。.化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方法，称为化学破碎法。常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton，Tween等 表面活性剂。.酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏，而

8、达到细胞破碎的目的。（二）核蛋白的解聚和蛋白质的去除1酚抽提法酚和氯仿是蛋白质变性剂，当它们与含核酸和蛋白质的 水溶液一起振摇时形成乳状液，蛋白质充分接触氯仿和苯酚而 变性，与核酸分开。离心后分为两相，一般上层为含有核酸的 水相，下层为有机相，相界处则是变性凝聚的蛋白质层。用有机溶剂处理核酸溶液时，既要使水溶液与有机溶剂充 分接触，又要注意防止剪切力对DNA的破坏。有机溶剂处理以去除蛋白质的次数视蛋白质的含量和制剂 纯度要求而定，一般要处理到中间变性蛋白质层消失为止。2表面活性剂法破细胞时所用的SDS等阴离子去污剂除了 可以溶解膜蛋白和脂肪外，还可解聚核蛋白。3蛋白酶水解法用蛋白酶水解去除蛋白

9、质的方法比较温和 ，可避免剪 切力的破坏。 （三）核酸的沉淀沉淀的目的：改变核酸溶解缓冲液；调整核酸浓度； 去除部分杂质及某些盐离子。 实验室常用的核酸沉淀剂为乙醇和异丙醇。n异丙醇：所用的体积小（一般为2/3体积），一般不 需要在低温下长时间的放置。但异丙醇不易挥发除去 。乙醇：很易挥发除去，但所需的体积大（一般为2倍 体积），且需要在低温下长时间放置（如沉淀RNA时 一般要-20至少放置2小时）。沉淀核酸时，一般还要加入一定浓度的盐溶液， 如NaAc或NaCl。这是因为在pH为8左右的溶液中 ，核酸分子是带有负电荷的，加一定浓度的NaAc或 NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少

10、 DNA分子之间的同性电荷斥力，易于互相聚合而形成 核酸的盐沉淀。加入的盐溶液浓度太低：只有部分核酸形成钠盐 而聚合，这样就造成核酸的沉淀不完全。加入的盐溶液浓度太高时：核酸沉淀中有较高浓 度的盐的存在，会影响到下游操作，例如DNA的限制 性酶切反应。此时必须要进行洗涤或重沉淀。 沉淀核酸时的温度、所需时间以及沉淀 后离心的速度和时间，取决于核酸分子的大 小，浓度以及有无助沉淀物存在。核酸分子 越小、浓度越稀，沉淀时所需温度越低，时 间也越长，离心时要求速度高、时间长。（三）核酸的洗涤离心沉淀得到的核酸一般还要用 70%的乙醇洗涤以去除盐分及一些小分 子的杂质，真空抽干或室温晾干后溶于适 当的

11、溶液中。n（四）核酸的浓缩n如果核酸溶液中DNA含量低，体积较大，不易 进行乙醇沉淀时，可采用固体聚乙二醇吸水浓 缩法或正丁醇抽提浓缩法进行浓缩。n固体聚乙二醇吸水浓缩法：将待浓缩的DNA溶 液装入透析袋中，在透析袋外加适量的固体聚 乙二醇，使DNA脱水达到浓缩效果。n正丁醇抽提浓缩法：利用部分水分子可分配于 有机溶液中，使溶液的体积减少，有机溶剂则 不吸取溶液中的DNA和其盐类分子。 （五）核酸制剂的保存分离提取到的核酸制品在保存过程中要防止变性和 降解。因此，溶解核酸的溶液必须含有螯合剂以抑制 DNA酶，溶液的pH为78，防止酸碱变性，同时该 溶液要有一定的盐浓度，因为在纯水中核酸双链（或

12、 双链区）的两条链上磷酸根负离子互相排斥，使双链 分开而变性，Na+等正离子可中和磷酸根的电负性， 保持双链结构。现在较普遍是将DNA溶于TE溶液（ 10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0 ），-20保存。而RNA则通常溶于DEPC水中。（六）核酸制剂纯度的初步鉴定纯净的核酸制品在260 nm波长处有吸收高峰，230 nm为吸收低谷。核酸 的紫 外吸 收曲 线 纯度：A260/A280 ：双链DNA为1.8，而RNA为2.0。含量：n 50A260样本稀释倍数1000双链 DNAug/uln 40A260样本稀释倍数1000单链 DNARNA ug/uln

13、33A260样本稀释倍数1000单链 寡聚核苷酸ug/ulDNA第二节 酚氯仿抽提法分离基因组DNA 酚氯仿抽提DNA的原理n去除蛋白质最经典的方法是酚氯仿抽提 法，也是最常用的方法。n酚氯仿抽提法的原理是：利用核酸与蛋白 质对苯酚的变性作用具有的不同反应性分 离核酸与蛋白质。在细胞破碎步骤后的样 品混合液中用苯酚抽提和高速离心后，样 品中的蛋白质成分被变性，或者变成不溶 性物质，而核酸则溶解在水相中。 n苯酚抽提通常采用苯酚、氯仿和异戊醇的 混合溶液。这种混合溶液比单纯的苯酚更 有效地使蛋白质变性，并且有助于稳定 RNA，随后氯仿、异戊醇抽提，将残留苯 酚从水相中（含核酸）除去。最后用乙醇

14、沉淀DNA，同时也可去除残留的氯仿试剂配制要求及作用n酚的重蒸馏和平衡n酚易氧化，其氧化产物对DNA有破坏作用，使 用前需要将酚进行重蒸馏。苯酚65熔化后， 用空气冷凝管进行重蒸馏，183收集纯净酚。n由于酚是中强酸使用前要进行酚的平衡，在纯 净酚中加入等体积的1mol/lTris-HCl缓冲液 (pH8.0)并加入固体Tris，激烈震荡使酚的pH 值平衡到8.0。酚中常加入抗氧化作用的8-羟基 喹咛，8-羟基喹咛使酚呈现黄色，可作为指示 颜色。将酚保存于棕色瓶中，表面覆盖一层 0.1mol/lTris-HCl(pH8.0)防止氧化。 n酚氯仿异戊醇混合液配制n氯仿为挥发性有机溶剂，可使蛋白质

15、变性，加 入氯仿可以:n1.减少酚的用量；n2.使蛋白质变性更为彻底；n3.同时可抑制核酸酶的活性。n异戊醇可消除抽提时有机相和水相之间产生的 气泡，有利于分层。n通常按酚氯仿异戊醇25241比例将三种 试剂混合，要求用时临时配制。 主要所需的试剂及消耗品: TES溶液 蔗糖-TES溶液 溶菌酶(50mg/ml) EDTA溶液(0.25mmol/ml) SDS溶液(10g/l) 饱和酚:氯仿:异戊醇(PH8.0) NaAc（3mol/l） 无水乙醇，70%的乙醇n实例：n原核生物（大肠杆菌）基因组DNA的分离纯化 过程n1. 吸取已培养好的大肠杆菌液体5.0ml于中号 试管中,4000转/mi

16、n离心15min，弃去上清 ，加入一定体积的TES液，洗菌体12次，如 上述方法收集菌体，将培养细菌的一些营养物 的清洗干净。n2. 弃去TES液后，管底菌体大约200ul，加 入五倍体积的预冷蔗糖-TES液约1ml，在冰浴 中充分混匀，加入溶菌酶（50mg/ml）至终 浓度1mg/ml，（计算方法， 50x=11,x=0.02ml）充分混匀后，在 0处理15minn 该步骤作用为破坏细胞壁，为了防止酶的变 性，需低温处理，同时加EDTA抑制DNA酶。n3. 加入EDTA（0.25mol/l）至终浓度为0.1mol/l ( 计算为0.25X=0.1（1+X）约取0.25mol/lEDTA 600700ul轻轻混匀后，0处理10min。充分抑制 DNA酶的活性，再加入SDS或（蛋白酶K）溶液至终浓 度为10g/l，混匀，于37裂解30min