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1、蛋白质相互作用技术研究方法 蛋白质是生命活动的主要执行者 蛋白质的功能主要通过与蛋白质以及其他生物分子的相互作用来实现蛋白相互作用组学（interactomics) 相互作用 网络 功能举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现， 然而单纯的基因组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基 因是相对静态的，而基因编码的产物蛋白质则是动态的 ，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行 者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与 生物功能相关。在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可 少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源 或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其
2、基因的 表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有 很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性 。有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是 和伴侣分子或是与其他蛋白质一起 发挥作用的。为了更好地理解细胞 的生物学活性，必须很好地理解蛋 白质单体和复合物的功能，这就会 涉及到蛋白质相互作用的研究。 生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同 作用 新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现 细胞信号转导及病原体感染和免疫反应 因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建 立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组 学研究中的热点。研究蛋白质相互作用的方 法
3、也就具有更为重要的意义。蛋白相互作用组学是系统生物学各种”组”学研究技术的新分支，它通过系统研究生物体各种蛋白分子间的相互作用，发现和鉴别分子机器、途径和网络，构建类似集成电路的生物学功能模块，并在研究模块的相互作用基础上绘制生物体的相互作用图谱，由此将单个未知蛋白置于相互作用网络的不同功能模块中，通过已知功能蛋白的上下文来阅读未知蛋白的功能。 2001年 酵母双杂交 酵母的蛋白相互作用网络图PNAS, 2001,98:4569-4574 Nat Genet, 2001,29:482-486 3844 combinationsFig. 3. Biologically intriguing in
4、teraction networks. The arrows indicate the orientation of each two-hybrid interaction, beginning from the bait to the prey. Hypothetical proteins of unknown functions are indicated by black ovals with white letters. 幽门螺杆菌(H. pylori) Nature, 2001, 409:211-215 秀丽隐杆线虫（C. elegans） Science, 2004,303:540
5、-543 黑腹果蝇（D. melanogaster） Nature, 2007, 445:95-101 恶性疟原虫（P. falciparum） Nature, 2005,438:108-112 人类 Cell, 2005,122:957-968 分子机器，信号途径，代谢通路等。我国的人类肝脏蛋白 质相互作用网络正在进行。J Bacteriol, 2005,187:2233-2243 Plant Mol Biol, 2007,63:703-718 Mol Cell Proteomics, 2006,5: 2279-2297 免疫共沉淀荧光共振能量转移技术噬菌体展示技术酵母双杂交技术基因外抑制子
6、合成致死筛选分子生物学方法蛋白质亲和色谱法 遗传学方法蛋白质相互作用研究方法生物物理学方法细菌双杂交技术蛋白质亲和色谱 protein affinity chromatography 基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose离子交换琼脂糖），当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。融合蛋白pull-down实验为了更有效地利用蛋白质亲和色谱，可以将待研究的蛋白以融合蛋白形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化的配体蛋白相融合。1988年 Smith等利用谷
7、胱甘肽S转移酶（glutathione-S-transferase ,GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到极大的推广。GST融合蛋白在经过固定有GSH(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞 抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面 ：一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用洗脱（2）结合（3）检测（6）收集（5）洗脱（4）固定诱 饵蛋白 （1）以上两种方法都有共同
8、的缺点：假阳性。实验所检测到的相互作用可能是由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，可能是由第三者作为中介的；有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。实验结果还应经其他方法验证。 以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。该法的优点是蛋 白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状 态下进行，可以避免人为影响；可以分离得到天 然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物为直接相互作用的两种蛋白，另外灵敏度不 如亲和色谱高。免疫共沉淀 coimmunoprecipitation 在两个
9、不同的荧光基团中，如果一个荧光 基团（供体）的发射光谱与另一个基团（ 受体）的吸收光谱有一定重叠，当这两个 荧光发色基团在足够近（100埃）时，就 可观察到荧光能量由供体向受体转移的现 象，即以前一种基团的激发波长激发时， 可观察到后一个基团发射的荧光。荧光共振能量转移技术 fluorescence resonance energy transfer , FRET BFP-GFP CFP-YFP激发波长 发射波长B: blue 383 448G: green 488 510C: cyan 434 477Y: yellow 513 532 荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象
10、变化，也能研究分子间 的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵 敏，分辨率高，能够检测大分子的构象变化 ，能够定性定量的检测相互作用的强度。 缺点 此项技术要求发色基团的距离小于 100埃。受荧光发色基团空间距离的限制,只 能研究分子量小于200 kD的蛋白，而且检测的设备昂贵。噬菌体表面展示技术噬菌体表面展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的。 其原理是将 蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利 用目的蛋白质与特异配基的亲和力，筛选和配基 特异结合的蛋白质。噬菌体展示技术一般要经过 多轮的筛选，这样就可以得到在文库中含量很低 的与配基特异作用的蛋白质。丝状噬菌体蝌蚪形噬
11、菌体噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体M13噬菌体最关键的优势：1. 淘选的高效率使得在极低的存在水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；2. 所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；3. 展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白 质的序列分析既快速又简便。缺点：（1）在噬菌体展示过程中必须经过多个过程，大大限制了所建库的容量和分子多样性。目前，常用的噬菌体展示文 库中含有不同序列分子的数量一般限制在109。（2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达。（3）噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样
12、性。（4）由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有 效表达和展示。酵母双杂交技术基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立 的结构域组成。分别使结合域和激活域同 诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真 核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相 互作用，则可使结合域和激活域在空间上 充分接近，从而激活报告基因。 优点：简单快速，具有非常高的灵敏度，常 用于发现和研究新蛋白的相互作用和功能 。缺点：某些蛋白本身具有转录激活活性或 DNA结合活性而产生自激活效应，从而产生假阳性；要求互作蛋白定位于核内，而 定位于胞浆或膜
13、上的蛋白互作则得不到检 测，从而产生假阴性结果；结构域的引入 会对目标蛋白的折叠或构象产生不可预知 的影响等。 在酵母双杂交系统基础上发展起来的较为方便、快速和灵敏的检测蛋白质之间相互作用 的方法。据原理可分为基于转录激活、基于 转录抑制，基于酶片段互补和基于信号级联 反应重建的细菌双杂交系统四类。细菌双杂交技术细菌腺苷酸环化酶型双杂交系 统（BACTH) 原理示意图百日咳杆菌B.pertussis在大肠杆菌腺苷 酸环化酶基因缺 陷株中共表达 这种细菌双杂交技术有效利用了cAMP信号通路，使得融合蛋白的互作和转录机器在空间 上分离，因此有效克服了酵母双杂交和其他 细菌双杂交系统的一些内在缺陷，
14、如非特异 互作，不能用于转录因子和膜蛋白、分泌蛋 白的研究等。 筛选快捷，操作简单，成本低廉，非常适合 构建快速、低耗、规模化的相互作用筛选技 术平台。缺点 细菌缺乏翻译后修饰系统，真核蛋白不能得 到适当地折叠和翻译后修饰，使得该系统筛 选到生理作用蛋白的可能性降低。 结构域的引入对目标蛋白的折叠过程或构象 可能产生不可预知的影响，从而导致假阳性 或假阴性结果。 由于该系统中设计的都是融合蛋白, 因此其 特性与单纯的蛋白并不一定精确对应, 这样 蛋白质间相互作用的结果可能与真正结果有 些误差。蛋白质芯片 ( protein microarray)在固体支持物表面高密度地固定化排列探针蛋白点阵,
15、以特异地捕获样品中的靶蛋白,然后通过检测 器对靶蛋白进行定性或定量分析。主要用于进行自 动化分析,支持高通量快速筛选。能够同时高效地分 析上千种蛋白质间的相互作用,也使得在全基因组水 平研究蛋白质的功能(如酶活性、抗体特异性配体、 受体交互作用)成为可能。但该项技术的使用受到了 蛋白质固定化技术以及载体材料选择的限制,同时也 需要复杂昂贵的仪器来对样品进行预处理和检测。 Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的几百样品转移到NC膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素 的诱饵蛋白发生作用，最后显影。 缺点是转膜前需要将蛋白复性。 等离子表面共振技术（Surface plas
16、mon resonance）将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的金 属膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱 饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改 变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质 之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏 快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振 检测仪器。遗传学方法使某处发生缺损，检测对其他地方的影响。基因外抑制子。基因外抑制子是通过一个基因的突变 来弥补原有基因的突变。比如相互作用的蛋白A和B ，如果A发生了突变使两者不再相互作用，此时B如 果再发生弥补性突变就可以使两者的相互作用恢复， 那
