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1、细菌的染色和涂片观察第一节 不染色标本检查法l所谓不染色标本检查法是将细菌标本不经 染色直接镜检，从而观察生活状态下细菌 的形态及运动状况的一种检查方法。这种 检查方法虽可看到细菌的大致轮廓，但主 要用于观察细菌的动力。一、不染色标本检查法的具体方法l1 、压滴法 l2、悬滴法 l3、毛细管法第二节 染色标本检查法l所谓染色标本检查法是用特殊的手段对细 菌进行染色，而后再检查其形态、大小、 排列方式、染色反应以及特殊结构的一种 检查方法,有助于细菌的初步识别或诊断。细菌染色的一般程序l细菌染色的基本程序是： l涂片 固定 （媒染） 染色 （脱色）（复染）1、 涂片制备：l 随标本的种类而略有不
2、同。一般临床标本大多可 直接涂抹于洁净载玻片上；培养的细菌，若为液 体培养液，亦可直接涂于载玻片上；若为固体培 养基上的细菌，则先取一接种环生理盐水于载玻 片中央，然后从培养基上取菌少许，在盐水中研 磨均匀，使呈轻度乳浊，以接种环扩成1cm2或2 份硬币大小的涂面，在室温下自然干燥或放在火 焰上方的热空气中慢慢烘干。但切忌紧靠火焰烤 干。2、 固定：l 染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和 其它细胞结构成分而杀死细菌；使菌体粘附于玻 片上以及改变细菌对染料的通透性（因活菌通常 不易使染料透入细胞内）。 l 固定的方法一般采用火焰加热法，在特殊目 的时也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化
3、 高汞、重金属盐或氧化剂等进行固定。3、 媒染：l 媒染的目的是增加染料和被染物的亲和力。凡使 染料固定于被染物；或引起细胞膜通透性改变的 物质统称为媒染剂。常用的媒染剂有明矾、苦味 酸、金属盐、碘等。也可用加热法媒染。媒染剂 可用于固定之后，亦可含于固定液或染液中，也 可在初染之后复染之前进行。4、 染色：l随目的而选用适宜的染液。染色时，滴加 染液以覆盖涂面为度，染色时间随方法而 定。单染法只用一种染料如吕氏美兰、稀 释石炭酸复红等；而多数染色法需用第二 种染液进行复染。5、 脱色：l 脱色：是使被染物脱去已染上的颜色。脱色的目 的是观察细菌与染料结合的稳定程度，故可作为 鉴别染色之用。
4、l 凡具有脱色作用的化学试剂称脱色剂。脱色剂或 呈溶媒作用，如醇类、丙酮等；或能影响蛋白质 的电离程度，改变其电荷性质或数量，因而影响 细菌与染料的结合程度，如酸类能减少细菌的负 电荷，故可作碱性染料的脱色剂。6、 复染：l 已经脱色处理的细胞或其结构常以复染液作复染 以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成鲜 明对比，所以复染也称为对比染色。复染液不宜 太强，以免掩盖初染的颜色而失去对比作用。常用染色法l细菌的常用染色法有：单染色法、复染色 法、特殊结构染色法、负染色法以及荧光 染色法等。（一）、单染色法： l单染色法是指用一种染料进行染色的方法 。如用美兰或稀释石炭酸复红等，使各种 细菌均
5、染成同一种单一的颜色。故此法只 能显示细菌的形态及大小，对细菌的鉴别 价值不大。（二）、复染色法： l复染色法是用二种以上染料进行染色的方 法。此法除显示细菌的形态、大小外，还 有鉴别细菌种类的价值，因此也称鉴别染 色法。常用的鉴别染色法有革兰氏染色法 及抗酸染色法。1、 革兰氏染色法（Grams Stain）l是最常用的鉴别染色法之一。此染色法是 由丹麦细菌学家 Christian Gram氏于1882 1884年发明的，至今已逾百年，仍在广 泛使用，是细菌学中最为经典的染色方法 。（1）、革兰氏染色的方法：固定初染媒染脱色（结晶紫或龙胆紫 ） （ 卢戈氏碘液） （95%酒 精）复 染（稀释
6、复红）固定 初染 媒染 脱色 复染 革兰氏阳性菌，用符号“G+”或“GP” （Grams Positive）表示。 革兰氏阴性菌，用符号“G”或“GN”（ Grams Negative）表示。 革兰氏阳性葡萄球菌例子 (金黄 色葡萄球菌 x 1000)革兰氏阳性链球菌例子革兰氏阴性杆菌例子 (大肠杆菌 x 1000)革兰氏阴性弧菌例子革兰氏阳性产芽孢杆菌例子 革兰氏阳性短杆菌例子 (李斯特 菌 x 1000)革兰氏阴性弯曲菌例子革兰氏阳性棒状杆菌例子革兰氏染色的结果与培养基成分、培养条件、操 作技术及菌龄等有密切的关系。 培养基成分：在缺乏镁盐的培养基中，革兰氏阳 性菌可变为革兰氏阴性菌。 培
7、养条件：在酸性环境中细菌带正电荷。 操作技术：如涂片太厚影响酒精脱色，革兰氏阴 性菌则可染成革兰氏阳性菌；脱色时倘酒精作用 时间太长，革兰氏阳性菌又会染成革兰氏阴性菌 。 菌龄：菌龄也能影响染色的结果，这和细菌生长 过程中核酸含量的改变有关。例如本是革兰氏阳 性的老龄菌，因核酸减少则常有许多菌细胞变为 革兰氏阴性。革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖含量较多，脂类较少 ，与95%酒精接触后可迅速导致细胞壁脱水，通透 性降低，使在细菌细胞内着色的染料结晶紫与 碘的复合物不易透出，所以保留了紫色。而革兰氏 阴性菌细胞壁含肽聚糖较少、脂类较多，与95%酒 精接触后肽聚糖脱水不明显，而脂类被酒精溶解后 使细胞壁
8、通透性增加，酒精易透入菌体内溶解染料 碘复合物并使其透出，因而使紫色被洗脱后又 被染成红色。3）、革兰氏染色法的临床意义l、鉴别细菌：该染色法可将细菌分为GP 菌与GN菌两大类，这样可以初步识别细菌 、缩小范围，便于进一步鉴定。 l、了解细菌与致病性的关系：大多数GP 菌的致病物质主要为外毒素；而大多数GN 菌的致病物质主要为内毒素。通过革兰氏 染色，可了解细菌的致病物质，从而做出 相应的治疗对策。、选择抗菌药物：GP菌和GN菌在细胞壁等 结构上有很大差别，因而对抗菌药物的敏感 性不同。如大多数GP菌对青霉素、红霉素、 头孢菌素等敏感；而大多数GN菌对这几种抗 生素不敏感，但对链霉素、氯霉素、
9、庆大霉 素、卡那霉素等敏感，故临床上可根据病原 菌的革兰氏染色性，选择有效的药物进行治 疗。2、 抗酸染色法l有些细菌如结核杆菌、麻风杆菌等分枝杆 菌，用一般染色法不易着色，必须使用强 染色剂（如石炭酸复红）并采用加热和延 长染色时间的方法才能使其着色。且一旦 染上颜色后又不易被酸性酒精脱色。这种 能够抵抗酸性酒精脱色的细菌，称为抗酸 杆菌。应用这种原理进行染色的方法叫抗 酸染色法。抗酸染色法常用的有萋纳二 氏染色法和潘本汉氏染色法。染色的步骤：直接涂片法夹层杯液基集菌法：固定初染脱色复 染 石炭酸复红加热 3%盐酸酒精 吕氏美兰染色过程中的细菌颜色变化：抗酸杆菌非抗酸杆菌镜检与报告：用光学显
10、微镜镜检(目镜10，油镜100)染色痰片。在淡蓝 色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。所 见结果按下列标准报告： l 1)抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸 杆菌。 l 2)抗酸杆菌(1+)： 19条抗酸杆菌100视野。 l 3)抗酸杆菌(2+)： l一9条抗酸杆菌10视野。 l 4)抗酸杆菌(3+)： 19条抗酸杆菌每个视野。 l 5)抗酸杆菌(4+)： 10条抗酸杆菌每个视野。 抗酸染色的意义： 用以鉴别抗酸菌（如结核杆菌和麻风 杆菌）和非抗酸菌。（三）、特殊结构染色法l细菌的某些基本结构如细胞壁、核质、胞 浆颗粒和特殊结构如荚膜、芽孢、鞭毛等 ，用普通染色法不
11、易着色，须用一些特殊 染色法才能染上颜色。特殊染色法主要有 荚膜染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法、 异染颗粒染色法等。这些染色法不仅能使 特殊结构着色，还可使特殊结构染成与菌 体不同的颜色，有利于观察和区别。在细菌检验工作中，除异染颗粒染色法较常用外 ，由于其它特殊结构染色法操作费时，费用较高 、染色过程要求非常严格，而普通染色法虽不能 使特殊结构本身着色，但菌体着色后，荚膜和芽 孢部分由于不着色也能显示出来，再加上特殊染 色法比较复杂，故日常工作中较少使用这些特殊 结构染色法（四）、负染色法l 所谓负染色法是指使背景着色而细菌本身不着色的一种染 色方法。常用的有墨汁染色法。也可用酸性染料如刚果红 或水溶性苯胺黑等进行染色。因酸性染料带负电荷，而细 菌本身在近乎中性的环境中也带负电荷，同种电荷相排斥 ，故染色时菌体不着色，而只能使背景着色。实践中常用 墨汁负染色法配合单染色法（如美兰染色法）检查细菌的 荚膜，使背景成黑色；菌体呈蓝色；而荚膜不着色，从而 使荚膜包绕在菌体周围成为一层透明的空圈。酸性染料染色墨汁染色（五）、荧光染色法l用荧光染料进行染色检查的技术称为荧光 染色法。
