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1、复旦大学硕士学位论文免疫受损大鼠肺部感染肺血管损伤机制及抗氧化干预研究姓名：徐金富申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：瞿介明20040501q ，文摘监中文摘要免疫受损宿主( i m m u n o c o m p r o m is o dh o s t ，I C H ) 近年米不断增加，I C H 肺部感染的发病机制尚存在众多未知凶素。I C i i 肺部感染时中性籽细胞浸润明显较J 卜常免疫状态宿主少，但炎症反应及肺损伤出血明显，肺水肿加重，b = l 般易影响到令身，甚至宿主的死亡。明确I C IJ 月市部感染肺损伤的相天机制，对于研究防治I C H 肺部感染肺损伤的可能方法和从而降
2、低其病死率具有一定的潜在价值。本课题从氧化抗氰化失衡任I C H 大鼠肺部感染作用、抗氧化I 二预对I C H 火鼠肺部感染肺向管损伤和表面活性物质的影响、I C H 大鼠肺部感染N O S 基因表达与肺血管损伤相关性三个方面探讨1 c H 肺部感染的肺损伤机制。第一部分氧化抗氧化失衡在I C l t 大鼠肺部感染肺损伤中的作用目的：探讨氧化抗氧化系统的失衡存I C t l 肺部感染肺损伤l _ 的作用。方法：以清洁级s D 大鼠为研究对象，连续7d 联合使用免疫抑制剂环磷酰胺( 1 5m g k g d 1 腹腔内注射) 和醋酸可的松( 1 0 0m g - k g 一d 1 皮下注射) 建
3、立I C H 模型，以气管内接种细菌的方式建立肺部感染模型，以正常免疫状态大鼠作为对照，观察感染前后共7 个时间点( 感染建立前0h ，感染建立后3 h 、6 h 、9 h 、2 4 h 、4 8 h及7 2h ，每个时间点分别取6 只大鼠) 的各种指标，包括外蒯血白细胞、存活率、氧化抗氧化指标如血清及肺组织匀浆巾超氧化物歧化酶( S O D ) 、丙二醛( M D A )含餐，肺组织细菌负荷，光镜及电镜观察肺组织病理学等。结果：I C t l 组向细胞低于4 1 0 。1 ；I C H 组M D A 明显高于对照组，肺组织细菌负荷逐步升高不回落，而S O D 明显低于对照组；肺组织病理学显示
4、I C H 组肺损伤严重，肺充血，出血明彤，肺匕皮细胞凋亡小体形成；免疫受损绍大鼠存活牢明显低r 对照组( 7 9 2 V S9 7 6 ) 。结论：I C I I 大鼠肺部感染时肺损伤明显重于正常免疫状态大鼠，且恢复缓慢，存活率明湿低于正常免疫状态火鼠，氧化抗氧化系统在I C H 大鼠肺部感染时人鼠的肺组织和血清巾存在严重的失衡，氧化抗氧化系统的失衡在I C H 肺部感染的肺损伤中坷能起重要作用。中文摘要第二部分抗氧化干预对I C I t 大鼠肺部感染肺血管损伤和表面活性物质的影响目的探讨抗氧化f 预对免疫受损大鼠肺部感染肺损伤的治疗作用。方法以清洁级S D 大鼠为研究对象，建立免疫受损模型
5、及铜绿假单胞菌肺部感染模挺，N 一乙酰一L 半胱氨酸( N A C ) 作为抗氧化剂进行抗氧化丁预，以末使用N A C 的免疫受损组为对照组，观察感染0 h ，3 h ，6 h ，9 h ，2 4 h ，4 8 h 和7 2 h 共7 个时间点的备种指标，包括外劂血白细胞、存活率、氧化抗氧化指标，肺组织细菌负荷，肺血管渗透性指标和肺湿干比( W D ) ，肺组织病理学改变，肺表面活性物质A 等。结果干预组M I ) A 明显低于对照组，丽S O D 明显高寸对照组，两组肺组织细菌负荷无明显差异，干预组大鼠存活率高于对照组( 7 9 2 V S 8 5 7 ) ；支气管肺泡灌洗液中S P A 的
6、含量干预组明显高于对照组( p O 6 且p O 0 5 ) 。在午H 同的观察时间窗里，抗氧化干预组和对照组大鼠的死亡数分别为7 只和1 1 只，其死亡率分别为1 4 3 ( 7 4 9 ) 、2 0 8 ( 1 l 5 3 ) ，两组死1 、：率的差异有统计学意义( p O 0 5 ) ( 幽2 1 ) 。图2 1 肺组织细菌负荷( c f u m 1 )三、血清及肺部氧化抗氰化指标两组血清S O D 开始即迅速下降，到9 h 后F 降缓慢，B 组未出现回升，A 组S O D卜降也较迅速，9 h 后处于平台波动，统计分析显示A 组与B 组各点之问差异均有统计学意义( p O 0 5 ) ；
7、两组i N O S 比较，I C H 组明显高丁对照组组，且高峰出现在9 h 处，在感染后6 h 、9 h 和2 4 h 差异有统计学意义( p O 0 1 ) ；而两组e N O S 作比较，I C H 组各点均低于对照组，且感染后6 h 和9 h 差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 。随着时间的推移，i N O S 和e N O S 均【出现下降，但e N O S 下降更明显且低于感染前水平。所有N O S G A P D H 荧光强度比值以其本身的G A P D H堡三型坌! ! ! ! 查垦些苎壁墨堕型竺! 苎型耋些篁壁堕笪塑鱼旦丝堕堕塑为参照行半定量。如图3 2 、图3 3 和表
8、3 - - 3 。5 0 0 b p - - - - - 2 0 0 哑斗n N O Si N O Sc N O S图3 2 ：n N O S 、i N O S 和e N O S 的R T - P C R 产物电泳条带产物人小分别为2 4 0 b p 、5 7 0 b p 和3 6 0 b p图3 - - 3 ：肺组织内参照G A P D H R T - P C R 产物电泳条带，大小4 3 5 b p表3 3 ：两组各点荧光强度比值O S G A P D H ) L L 较O h3 h6 h9 h2 4 h4 8 h7 2 hn N O S G A P D HA0 1 4 00 301 8
9、00 40 1 7 - L 00 202 0 0 401 8 00 501 9 00 801 6 O11B015 0 0 401 7 O 0 301 9 土00 601 6 a ：00 701 7 00 201 8 0 0 701 5 O0 8i 丽丽面丽r 百磊丽r 丽面丽1 蕊五万1 而五孑1 面i 丁弋瓦五F 百面B03 3 0 0 504 8 a ：0 1 405 2 00 505 I 00 604 3 00 60 4 1b 0 03 6 0 1 0e N O S G A P D HA01 9 0 0 602 3 01 90 2 6 - t ：00 7 。03 1 00 4 ”01 6
10、 01 301 3 01 1O1 l 00 8一_ 一B02 3 0 1 40 3 8 00 803 9 O 0 304 2 _ l ：00 302 7 O0 302 1 0 0 80 1 8 0 0 7A 为I C H 组，B 为对照组，+ 同一时间点比较，高j 二对照 刚1 差异有统计学意义( p o 0 5 )# 同一时间点比较，低于对照组月差异有统计学意义( P 00 5 )5 3第三部分I C H 人鼠删嘟感染时N O S 基因表_ i 占与肺向管 _ 6 伤相关忡研究三、肺血管渗透性损伤情况两组肺f i l 管渗透性均随感染时间的变化而改变，正常对照组在6h 达到高峰，随后明显F
11、降；而I C t t 组高峰出现在9h ，随后也丌始下降，但下降过程中有波动( P 0 0 1 ) 。结果见图3 4 。訾( ) 0 6击 耋o 0 5O0 4O - 0 3O 0 20 0 109 U 、肺水肿指标图3 4 ：B A L F 血清蛋白比值两组肺温干比均在9h 时最高，随后下降，1 F 常对照组在7 2h 时基本趋于正常水甲：而I C H 组在7 2h 时仍明显高于感染前( 尸 0 0 1 ) 。结果见图3 5 。3 h图3 5 ：肺组织湿干比翌礓旧饵嘶rLL。P，-1掣蕾他m864oj第一部分I C H 夫鼠肺部感染时N ( ) s 基表达一j 肺血管于员伤相关性研究- K
12、、N O S 皋凶与肺损伤指标间相关性分析结果( 样本数n = 4 2 )i N o S 和e N O S 基因表达与肺损伤指标作B i v a r j a t e c o r r e l a t i o n s 过程相关性分析，结果如表3 4 。壅三二! ! 圣变量趔旦i ! 丝生! g Q 坚! ! 型i 垒堕造猩筮扭 i N O Se N O S 肺血管渗透性I C H 纽r = 0 7 9p 0 0 1r = 0 2 8p O 0 5 对照组r ：O 7 3p O 0 1r - O 3 6p O 0 5 肺湿干比I C H 组r = 0 6 lp O 0 1r = O 3 5p 0 0
13、 5 过盟型! 三Q ：堑P 三Q ：Q !Q ：!E 三Q ：Q 筇三部分I C H 人鼠肺部感染时N O S 笨表选0 肺I m 管损伤树关性圳f 究讨论n N O S 存在于视网膜、植物神经纤维、大脑皮层、海马、垂体后叶、丘脑、嗅球区粒细胞层、骨骼肌细胞和平滑肌细胞。i N O S 存在十肝细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞。e N O S 存在于血管肉皮、支气管内皮和海马锥体细胞层。利用特异的D N A 探针已经汪明N O S 三型基凶分别定位丁1 2 号( 1 2 q 2 4 2 2 4 3 ) 、1 7 号- ( 1 7 p l l 1 7 q 1 1 ) 、7 弓- ( 7
14、 q 3 5 3 6 ) 染色体“1 。N O S 三种亚璎在肺部均有表达，但与肺部感染关系密切的：卜要是e N O S 和i N O S I l ”。在肺部，e N O S 由肺血管内皮细胞、气道上皮细胞、肺巨噬细胞利l I 型肺泡上皮构成性表达，其活化依赖细胞内钙离子浓度的变化。e N O S 催化L 精氨酸合成生理性一氧化氮( N O ) ，在维持正常的I f L 管紧张性，抑制血小板聚集，抗血栓，抗炎，减轻肺血管渗透性等力面起作用“】。有报道I ”1 称高表达e N O S 的转基因小鼠在L P S 诱导的败血症休克中，其肺部炎症反应和肺损伤水肿均明显轻于对照组，且存活率高丁对照纽，提
15、示e N O S 可对抗内毒素的致肺损伤作用。i N O S 与炎症反应密切相必，在肺部其诱导性表达于多种细胞，这些细胞包括：肺部血管平滑肌细胞、内皮细胞、肺泡巨噬细胞和I I 型肺泡上皮细胞。其表达主要由细菌脂多糖( L P S ) 和细胞冈子( 如I F N v 、T N F i x 及I L 1 等) 所诱导。i N O S诱生N O f i 依赖于钙离子，而是依赖于N A D P H 、生物喋呤和黄素 1 5 , 1 8 , 1 9 。对N O的大量研究证实，生理性N O 可起到对抗病原体( 抗菌、抗寄生虫、抗病毒) 作用，但高水平N O 则造成组织损伤2 眦”。正常宿主肺部生理性N O 浓度波动于较低的水平，这 N O 是由构成性表达的n N O S 和e N O S 分泌，而i N O S 活性很低。但在肺部感染时则不同，i N O S 被激活，诱生较高水平的N O ，对伞身和局部造成病理损伤 1 5 , 1 6 , 2 5 】。既往已经有研究涉及肺部感染与N O S 表达的关系2 6 也8 1 。如有研究报
