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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ rag 基因型牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎患者中的分布不同 rag 基因型牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎患者中的分布作者：汪贯华,张冬梅,潘亚萍 作者单位：中国医科大学附属口腔医院 牙周科，辽宁 沈阳 110002 【摘要】 目的 分析不同 rag 基因型牙龈卟啉单胞菌在慢性牙周炎患者中的分布状况。方法 收集 50 例慢性牙周炎患者的150 个龈下菌斑样本，采用 16S rDNA 聚合酶链反应（PCR）法检测牙龈卟啉单胞菌在牙周炎病变位点的检出率，并根据各 rag 基因型的特异性引物检测牙龈卟啉单胞菌不同 rag 基因型在慢性牙周炎病变位点的分布。结果 经
2、16S rDNA PCR 法检测，病变位点牙龈卟啉单胞菌阳性检出率为 70.7%。各 rag 基因型在牙龈卟啉单胞菌阳性位点的总检出率：rag-1 为 60.4%，rag-2 为 23.6%，rag-3 为44.3%，rag-4 为 15.1%；经统计学检验，rag-1 和 rag-3 型检出率较高，高于 rag-2 和 rag-4 型（P0.05） 。结论 慢性牙周炎患者龈下菌斑中的牙龈卟啉单胞菌存在 rag 基因多态性，rag-1 和 rag-3 基因型牙龈卟啉单胞菌与中国辽宁地区人群慢性牙周炎的发生发展关系密切。 【关键词】 牙龈卟啉单胞菌,基因型,rag 基因Distribution
3、of rag genotypes of Porphyromonas gingivalis in patients with chronic periodontitis WANG Guan-hua, ZHANG Dong-KKME-专业医学搜索引擎 http:/ PAN Ya-ping. （Dept. of Periodontics, School of Stomatology, China Medical University, Shenyang 110002, China）Abstract Objective To investigate the distribution of rag ge
4、notypes of Porphyromonas gingivalis（P.gingivalis） in chronic periodontitis patients. Methods Subgingival plaque samples were collected from 50 chronic periodontitis patients. The occurrence of P.gingivalis was determined by polymerase chain reaction（PCR ） using 16S rDNA-spe-cific primers. Distributi
5、on of rag genotypes was assessed in P.gingivalis positive samples by PCR. Results The occurrence of P.gingivalis was 70.7%, and the distribution of four rag genotypes among P.gingivalis positive samples was as follows: rag-1 60.4%; rag-2 23.6%; rag-3 44.3%; rag-4 15.1%, respectively. Conclusion P.gi
6、ngivalis with various rag genotypes was present in subgingival plaque samples from chronic periodontitis patients, and P.gingivalis with rag-1 and rag-3 were more predominant in chronic periodontitis patients, which may be associated with the development of periodontitis.Key words Porphyromonas ging
7、ivalis； genotype； rag gene牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是目前公认的慢性牙周炎的主要致病菌之一1，能分泌大量的毒力因子，导致牙周组织破坏2。以往，人们认为细菌的致病性是单因素的，或者说是细菌的某一个或几个致病因子发挥决定性作用。致KKME-专业医学搜索引擎 http:/ islands，PAI）的发现使人们对细菌致病性有了进一步的认识3。目前，rag 位点被确定是 P.gingivalis 的致病岛基因之一4 ，该位点主要含有基因 ragA 和 ragB，分别编码 RagA 和RagB 蛋白。RagA 是
8、TonB 类受体外膜蛋白；而 RagB 是一种表面抗原，Rag 蛋白构成膜转运系统，协助细菌从外部环境获取转运大分子，有助于细菌的存活和散播；同时 Rag 蛋白还能够激活宿主的免疫及炎症反应。研究证实，rag 位点的失活会降低 P.gingivalis 的致病性，减少对牙周组织的破坏5-6。rag 位点在临床菌株中有 4 种不同的基因型7-8，分别命名为 rag-1、rag-2、rag-3 和 rag-4，不同基因型的致病能力也不同。Hall等7发现，不同 rag 基因型的分布有一定的种族和地域差异。本研究采用聚合酶链反应（polymerasechain reaction，PCR）方法检测不同
9、 rag 基因型 P.gingivalis 在慢性牙周炎患者中的分布特点，探讨 rag基因型与慢性牙周炎的相关关系。1 材料和方法1.1 病例选择及牙周临床指标检查选择中国医科大学附属口腔医院牙周科就诊的慢性牙周炎初诊患者 50 例为研究对象，其中男 27 例，女 23 例，年龄 2473岁，平均年龄 43.4 岁，均为辽宁地区常住居民。慢性牙周炎的诊断标准采用 Armitage（1999 年）新分类法9，要求患者无全身系统性疾病，妇女无妊娠，至少 1 年未接受牙周系统治疗，近 3 个月内未服用抗菌药物，且知情同意。检查患者的牙周状况，记录牙周探诊KKME-专业医学搜索引擎 http:/ de
10、pth ，PD）和临床附着丧失（clinical attachmentloss，CAL） 。每例患者选取 3 个慢性牙周炎病变位点为取样位点，要求该位点 PD3 mm 且 CAL1 mm ；拍摄取样牙齿的X 线片，记录牙槽骨吸收程度。1.2 样本的采集及分组受试者清水漱口，采样患牙经龈上洁治后，无菌棉球隔湿，龈下刮治器取龈下菌斑，置于装有 1 mL PBS 缓冲液的无菌离心管中。所有检查及操作均由同一检查者完成，共采集菌斑样本 150 个。根据取样位点的牙周病变程度10，将 150 个菌斑样本分为 2 组：轻度慢性牙周炎组（简称轻度组）和中重度慢性牙周炎组（简称中重度组） 。轻度组 72 个样
11、本，取样位点 3 mmPD4 mm 、1 mmCAL2 mm、牙槽骨吸收不超过根长 1/3；中重度组 78 个样本，取样位点 PD4 mm 、CAL2 mm 、牙槽骨吸收超过根长1/3。1.3 模板 DNA 的提取 采用常规酚-氯仿法提取龈下菌斑 DNA。用紫外分光光度计测量所提取 DNA 在 260 nm 和 280 nm 处的吸光度值，计算二者比值。比值为 1.72.0 表示 DNA 纯度良好。1.4 P.gingivalis 和 4 种 rag 基因型的 PCR 检测P.gingivalis 16S rDNA 和 4 种 rag 基因型特异性引物序列见表 1，引物均由 TaKaRa 沈阳
12、联星生物技术有限公司合成。PCR 反应体系：10反应缓冲液 2.5 L，dNTP 2.0 L，引物各 0.5 KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Taq DNA 聚合酶 0.15 L，菌斑 DNA 2.0 L，用无菌双蒸水补足总体积至 25 L。PCR 循环条件：94 预变性 5 min，变性 94 45 s ，退火（16S rDNA 为 58 ，rag 为 50 ）45 s，延伸 72 1 min，35 个循环，最后 72 延伸 10 min。反应结束后用质量分数1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用 100 bp Ladder DNA Marker 确定产物的相对分子质量。P.ging
13、ivalis 标准株 W83 作为阳性对照（中国医科大学口腔医学院中心实验室提供） ，等体积双蒸水作为空白对照。PCR 质控：所有实验样本的测定均在盲法下进行，并随机抽取 10%的样本做重复性实验。1.5 统计分析用 SPSS 12.0 统计软件进行? 掊检验，比较 4 种 rag 基因型检出率的差异。检验水准为双侧 0.05。2 结果2.1 PCR 产物的电泳结果2.2 P.gingivalis 的 PCR 检测结果50 例慢性牙周炎患者检出 P.gingivalis 阳性者 43 例，占86.0。150 个龈下菌斑样本中，106 个菌斑样本 P.gingivalis 阳性，病变位点总检出率
14、为 70.7；轻度组 72 个菌斑样本和中重度组 78个菌斑样本中，P.gingivalis 阳性的样本分别为 48 和 58 个，检出率分别为 66.7和 74.4。经统计学检验，轻度组和中重度组P.gingivalis 阳性检出率无统计学差异（P0.05） 。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 不同 rag 基因型 P.gingivalis 菌株的分布4 种 rag 基因型 P.gingivalis 菌株的分布情况见表 2。从总检出率来看，rag-1 型的检出率最高，rag-3 型次之，均高于 rag-2 型和rag-4 型，且均有统计学意义。rag-1 型在中重度组的检出率高于轻度
15、组，rag-4 型在轻度组的检出率高于中重度组，其差异有统计学意义。另外，检测出不属于任何一型的样本 1 例。2.4 rag 基因型与中重度慢性牙周炎的联系强度4 种 rag 基因型与中重度慢性牙周炎的 OR 值和可信区间见表 3。由表 3 可见，rag-1 型和 rag-4 型与中重度慢性牙周炎的联系强度有统计学意义；rag-1 型基因与中重度慢性牙周炎的联系强度较高，为 3.10。3 讨论rag 位点已被确定为 P.gingivalis 的致病岛基因之一，该位点在临床菌株中有 4 种不同的基因型，提示不同 P.gingivalis 菌株的rag 基因存在广泛的异质性，而遗传异质性的变化又是细菌致病性差异的基础。本研究结果表明，rag-1 型的检出率最高，rag-3 型次之，rag-4 型的检出率最低；提示 rag-1 型和 rag-3 型 P.gingivalis 与中国辽宁地区人群慢性牙周炎的发生发展密切相关。4 种 rag 基因型的基因及氨基酸序列有较大差异，这可能与基因转移及重组的过程中发生的大片段基因的获得和缺失从而产生基因突变有关。尽管如此，4 种 rag 基因型所编码的 RagA 和 RagB 蛋白都分别与拟杆菌属的SusC 和 SusD 蛋白具有同源性。不同的是，RagA1 和 Ra
