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1、http:/ 生物分离用羧甲基壳聚糖 （CMCTS） 磁性纳米复合物的 制备与表征 夏金兰 1，廖鹏飞2，聂珍媛，王晶，肖水明 （中南大学资源加工与生物工程学院 中国 长沙 410083） E-mail： 摘 要摘 要： 首先采用改进的共沉淀法制备四氧化三铁磁性纳米粒子, 然后通过一步包埋法， 将 磁性纳米粒子用天然多糖物质羧甲基壳聚糖（CMCTS）进行直接包覆，制备出羧甲基壳聚 糖磁性纳米复合物。 透射电镜和粒度分析结果表明， 该磁性纳米复合物基本呈单分散、 球状、 粒度分布比较窄、平均粒径约为 12nm。FT-IR图谱和热重分析表明Fe3O4表面成功地包覆了羧 甲基壳聚糖。将该磁性纳米复合
2、物应用于鸡血细胞基因组DNA的分离，实验结果显示：该磁 性纳米复合物非常适合于基因组DNA的分离纯化，避免了传统苯酚氯仿法中有毒试剂的使 用，能够显著简化整个DNA的纯化制备过程，是一种很有发展前景的基因组DNA分离的方法。 关键词关键词：磁性纳米粒子； 磁性纳米复合物；羧甲基壳聚糖；基因组 DNA 分离 1. 引言引言 磁性吸附剂或载体以微球、 纳米复合物或表面化学修饰过的纳米粒子等形式出现时， 由于磁性载体的粒径小、比表面积大，容易与目标物质结合。它们在生物分离的众多领域中有着广泛的应用前景。如生物大分子的分离与纯化；细胞和细胞器的分离。同时，由于磁性吸附剂或载体的磁响应性、 纳米尺寸效应
3、和对靶向物质特异性吸附， 它们能通过外加磁场作定向分离，不需要离心操作，从而使相关的生物分离纯化过程简化，并且有利于实现实验的自动化操作1-9。 随着分子生物学、基因诊断和治疗技术的发展，有关快速、高效、可靠、无毒的核酸制备方法和分析技术越来越受到重视。 传统的核酸分离方法存在严重的不足， 如使用有毒试剂（苯酚、氯仿）、耗时等。表面修饰的磁性纳米吸附剂或载体可克服这些不足，因而在该领域显示出了极大的应用前景。 近年来的研究表明， 通过无机或有机聚合物进行表面修饰和包覆的磁性纳微米级粒子在核酸分离的应用领域的研究活跃。二氧化硅包覆的磁珠10、聚乙烯醇11、甲基丙烯酸聚合物磁性微球12-13便是该
4、类典型的核酸分离载体。 值得注意的是一些天然的多糖高分子化合物，如褐藻酸，壳聚糖，由于其良好的生物相容性和井然有序的活性基团，可以用于修饰磁性颗粒用于DNA 的分离的应用。最近，Prodlalo J等14 采用天然羧基多糖高分子化合物-褐藻酸修饰钴铁氧体磁性纳米粒子，制备出微米级复合物作为DNA分离载体成功的应用于鸡血细胞DNA的分离。 Chang Y-C 等15，16研究了利用碳二亚胺使壳聚糖通过化学健结合在Fe3O4磁性纳米粒子表面，制备出单分散性的羧甲基壳聚糖-Fe3O4磁性纳米粒子，并将其应用于Cu (II)、Co(II)的吸附。本文，我们通过一步包埋法，将磁性纳米粒子与天然多糖高分子
5、物质羧甲基壳聚糖（CMCTS）第一作者：夏金兰(1964-)，男，教授，博士生导师；电话：0731-8836944；E mail：。 第二作者：廖鹏飞(1980-), 男，硕士研究生；E mail：lfp_ -1- http:/ 通过静电吸引直接进行包覆， 制备出羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物， 并将该复合纳米粒子应用于鸡血基因组DNA的分离。据我们所知，这种复合粒子的制备方法及其在核酸分离中应用的研究还未见报道。 2. 材料和方法材料和方法2.1 材料材料 所用的化学试剂和溶剂都是分析纯试剂。蛋白酶K购自于德国Merk公司。琼脂糖来自于中国杭州微生物试剂厂，壳聚糖（脱乙酰度：90% 分子量：30
6、5kDa）购于中国浙江玉环海洋生物化学有限公司， 。 N,O-羧甲基壳聚糖 （CMCTS） 本实验制备参照文献17， 6-O-和2-N- 的取代度分别为0.84， 0.33。 鸡购于中南大学附近的专门动物市场， 取100ml 鸡血与20ml 0.5%的Na2EDTA抗凝剂混匀，备用。实验所用的水为双蒸水。 2.2 羧甲基壳聚糖羧甲基壳聚糖Fe3O4磁性纳米复合物磁性纳米复合物(CMCTS-Fe3O4)的制备的制备 Fe3O4纳米粒子的制备采用传统的共沉淀法18，并做一些改进：4.73g FeCl36H2O和 2.78g FeSO4 7H2O (摩尔比为 Fe3+/ Fe2+1.75:1)， 在
7、氮气的保护下溶解在100ml的双蒸水中，转入四口烧瓶中，通N2， 剧烈搅拌，温度升高63缓慢的滴加30ml氨水(25wt%)。反应溶液的颜色立即由橙色变为黑色。反应过程中，溶液pH维持在10左右。沉淀物在80下加热熟化30 min，双蒸水洗涤数次，将沉淀物用无水乙醇洗涤两次，最后在70下真空干燥，备用。 CMCTS-Fe3O4纳米复合物的制备如下： 将上述制备好Fe3O4纳米粒子(0.5g)用超声波分散在50ml双蒸水中，注入带有搅拌器与氮气出入口的250ml三口烧瓶中，将1.0g的羧甲基壳聚糖在氮气流保护下溶解于50ml双蒸水中，然后加入到三口烧瓶中。反应混合物超声波协助分散10 min后，
8、 通N2 在65搅拌2小时。 反应后， 混合物1500 rpm离心5 min， 以去除聚集物。最后产物真空冷冻干燥，备用。 2.3 CMCTS-Fe3O4磁性纳米复合物的表征磁性纳米复合物的表征 CMCTS-Fe3O4磁性纳米复合物的形态和大小采用透射电镜（TEM）(JEM-1230,JEOL.日本)拍照观察。 CMCTS-Fe3O4磁性纳米复合物的粒度分布通过Zeta电位 1%Triton-100; 0.012mol/L Tris-HCl PH 7.5） ， 混匀。 冰上放置20min， 溶血。 4000rpm离心5min，弃上清。重复上述步骤，至沉淀为白色。分别加入300l（小）、400l
9、（中）、1000l（大）的核酸胞溶缓冲液（10mmol/LTris-HCl PH8.0; 0.4mol/L NaCl; 0.2mol/L EDTA）充分混匀，悬浮，再分别加入15l（小）、20l（中）、50l（大）的SDS(20% w/v)，摇匀至混合液出现透明粘稠状。然后分别加入3l（小）、4l（中）、10l（大）蛋白酶K溶液（20mg/ml）轻轻混匀后置于50水浴3h。 然后分别加入30l（小）、40l（中）、100l（大） 羧甲基壳聚糖磁性纳米粒子悬浮液（50g/L, pH7.0 的磷酸缓冲液中）至离心管的细胞裂解液中，振荡摇匀。然后再分别加入200l（小）、280l（中）、700l（大
10、）杂交缓冲液(20wt % PEG, 2.5M NaCl)，混合并轻轻振荡，室温温育10min，磁力架固定，弃上清。70预冷乙醇溶液400l洗涤，除尽乙醇，室温蒸发剩余乙醇。加入80l TE ( 10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl, PH 8.0)溶液，在62水浴温育510min，洗脱复合物中的DNA。 PromegaTM，磁力架固定磁性纳米粒子，收集洗脱液，然后紫外可见分光光度计、琼脂糖凝胶电泳分析检测。其余存于-20.冰箱中备用。 用常规的苯酚/氯仿抽提方法分别从不同体积300l（小），400l（中）, 1000l(大)的抗凝鸡血提取血液基因组DNA作对照19
11、。 3结果与讨论结果与讨论 3.1 共沉淀法制备四氧化三铁纳米粒子共沉淀法制备四氧化三铁纳米粒子 在众多的Fe3O4纳米粒子制备方法中，以共沉淀法最简单和优越。但是在共沉淀法中,影响Fe3O4的磁性和粒度的因素很多，如Fe3+/Fe2+摩尔比，沉淀剂的种类，终点的pH值、以及熟化温度和时间等等，生成四氧化三铁的理论上Fe3+/Fe2+摩尔比为 2:1 但是Fe2+极易氧化，会影响Fe3O4结构与组成，从而影响磁性能20，因此在制备过程中适当的提高Fe2+的量是有利的。根据文献11实验采用Fe3+/Fe2+摩尔比为 1.75:1。NH3H2O相对于NaOH能够防止局部OH-浓度过高,导致粒度分布
12、不均匀。N2的保护，既能防止Fe3O4纳米粒子在制备过程中被氧化，又对粒子粒度的减少有利（相对于没有除氧的方法）21,22在制备四氧化三铁纳米粒子时， 一定时间和温度的熟化过程是必要的。 因为可能存在非晶态的羟基氧化铁还没有完全的转化成为晶态的Fe3O4,从而导致磁性减弱和不稳定。经过一系列实验，采用了在 80 熟化 30min。结果较好（结果未给出）。 3.2 羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物的制备 3.2 羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物的制备 磁性纳米粒子的表面修饰广泛用于赋予纳米粒子特别的吸附性， 生物相容性、 稳定性以及亲水性特征。根据文献23报道，主要有两种聚合物用于磁性纳米颗粒的修饰，一种是
13、合成的有机高分子材料，另一种是天然的高分子材料，后者因具有良好的生物相容性，富含活性功能基团等优点，被许多研究者所亲睐。羧甲基壳聚糖（CMCTS）是壳聚糖的一种衍生物，表面富含-NH2 , -COOH, -OH 活性基团，同时易于化学改性。目前有很多关于制备壳聚-3- http:/ 糖磁性复合物的报道，如悬浮直接交联法24、共沉淀法25、乳液交联法26等，但是这些制备方法过程非常复杂，有时还需要引入交联剂（如戊二醛、碳二亚胺等）而导致粒子表面的活性基团的减少。Fe3O4和CMCTS的等电点分别为 6.0 和 6.9，因此溶于双蒸水（pH6.5）Fe3O4纳米粒子和CMCTS的表面分别带负电荷和
14、正电荷，这就使得CMCTS通过静电作用吸附在Fe3O4纳米粒子的表面，然后再通过CMCTS与Fe3O4纳米粒子表面之间的范德华力，氢键还有配位键作用进一步稳定CMCTS-Fe3O4纳米复合物，基于这一理论，本实验采用一步悬浮包埋法，即在除氧的双蒸水中悬浮Fe3O4纳米粒子和CMCTS混合，在N2保护下反应 2 小时， 制备出羧甲基壳聚糖基磁性纳米复合物。 实验表明不经过任何表面包覆处理的磁性纳米粒子，放置在水溶液过程中会产生团聚，形成大的颗粒。而经过羧甲基壳聚糖（CMCTS）包覆的磁性纳米复合物不会发生这种现象， 原因可能是由于粒子小， 比表面积大产生的高表面自由能和其表面吸附了大量的吸附水、
15、配位水、桥OH及非桥OH基等，引发了磁性纳米粒子聚集成大粒子。羧甲基壳聚糖可以借助范德华力，配位键，氢健等作用吸附在磁性纳米粒子的表面，从而减少团聚的表面自由能。达到稳定磁性纳米粒子的作用。此外，磁性纳米粒子通过CMCTS包覆后，引进了CMCTS有用的活性基团，改善了其表面的亲水性和生物相容性。 3.3 CMC-Fe3O4纳米复合物的表征纳米复合物的表征 3.3.1 羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物的电镜照片和粒度分布羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物的电镜照片和粒度分布 CMC-Fe3O4磁性纳米复合物的透射电镜（TEM）图（图 1）表明该磁性纳米复合物的基本上呈单分散、 球状，平均粒径大约为 11.6nm。通过Zeta电位 (b) CMCTS-Fe3O4纳米复合物;(c) CMCTS Fig.3 FT-IR spectra measured by a transmission method (a)Fe3O4(b)CMCTS-Fe3O4nanocomposites; (c) CMCTS 3.3.3 TG/DSC 分析分析 羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物的TG/DSC曲线如图5所示。从图中可以看出从开始到600的范围内出现了一个大的放热峰， 并且出现了两次失重过程。 第一个失重过程从开始到200比较缓慢， 一般认为是磁性复合物表面的吸附水在热的作用下蒸发导致的。 第二个失重过程是从200到600
