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1、原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。 作者签名：拯二日期：易口旷年6 月分日关于学位论文使用授权说明本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。作者签
2、名：斌仁导师签名：纱智日期：厕年z 月7 日大鼠组织A T P 、D N A 、肌动蛋白含量与P M I 相关性研究硕士研究生：龙仁导师：熊平教授中文摘要目的：探讨死后大鼠骨骼肌和肝组织中A T P 、D N A 及骨骼肌肌动蛋白含量变化与死后经过时f 司( p o s t m o r t e mi n t e r v a l ，P M I ) 之间的相关性，观察死后两种组织A T P 、D N A 降解有无差异及环境温度对以上因素变化的影响，寻求较为准确地推断P M I 的新方法。方法：根据生物发光法及计算机图像分析技术的有关原理，应用液体闪烁分析仪检测不同环境温度下( 高温组3 0 3 5
3、 。C ；中温组1 5 - - - 2 0 ；低温组5 1 0 。C ) 大鼠死后0 2 4 h 骨骼肌和肝组织中A T P 的降解情况；同时应用细胞图像分析系统对染色后的切片进行分析，了解不同环境温度下大鼠死后0 - 9 6 h 骨骼肌和肝组织中D N A 及骨骼肌肌动蛋白的降解情况。结果：( 一) 、两种组织中A T P 含量从死后即刻( o h ) 开始即明显降解，约2 6 h 降解基本完全。不同组织及环境温度其降解速度不尽相同：肝组织较骨骼肌组织快，温度高比温度低快。统计分析：死后0 2 4 h 内，两种组织A T P 含量变化与P M I 之间有显著负相关性，其S p e a r m
4、 a n 相关系数均为一1 0 0 ，P 中滠缀 低溢组。各自S p e a r m a n 相关系数均为一1 0 0 0 ，P 2 0 0 0 0 。2 2 三组温度大鼠肝组织各估计P M I 与实际阴I 比较图( 图2 2 ) ：从图2 2 可知，在0 - 2 4 h 内，低、中、高三温度组各估计P M I 与实际P M I 均较为逼近，以低温组最为逼近，中、高温组则次之。图2 2 不同温度组肝组织各估计P M I 与实际P M I 比较第二部分不同温度下大鼠骨骼肌和肝细胞D N A 含量与P H I 相关性的图像分析材料与方法一、材料1 1 实验材料的收集及分组：取3 0 只健康W i
5、s t a r 大鼠( 只重3 0 0 3 5 0 克) 分组方法同第一部分。割断颈总动脉放血致死，于死后即刻( O ) 、3 、6 、9 、1 2 、1 8 、2 4 、3 0 、3 6 、4 2 、4 8 、6 0 、7 2 、8 4 、9 6 h 连续取后大腿骨骼肌和肝组织用1 0 甲醛固定，每个时间点样本1 0 个。1 2 主要试剂与配制：( 1 ) 无色s c h i f f 试剂【1 3 1材料：碱性晶，e 工( f u c h s i nb a s i c ，C I g H l 8 N 3 C 1 ) 、偏重亚硫酸钠( s o d i u mp y r o s u l f i t
6、 e , N a 2 S 2 0 5 ，上海试裁四】r 1 、浓盐酸、活性炭步骤： 1 】蒸馏水2 0 0 m l 煮沸。 2 】煮沸后离火，徐徐加入碱性品红1 0 9 并充分振荡溶解。【3 j 溶滚冷却至5 54 C 匿遗滤并热入戮鹣H C l2 0 m l 。 4 1 溶液冷帮至2 5 艇入穰曛亚硫酸钠1 5 9 密封后鬣4 “ C 冰箱2 4 h a 【5 1 加入活性炭2 9 充分振荡。【6 】过滤( 滤液成为无色)( 2 ) 1 0 福尔马林( 3 ) 无水乙醇( 4 ) 9 5 。驰乙醇( 5 ) 二甲苯5 NH c l 的醚铡：4 2 瓣浓楚羧惩蒸馏隶定客至1 0 0 m l 露
7、可1 3 主要仪器及设备：缨簸整像分褥系统( P I P S 一2 0 2 0 ，o l y m p t t sB X - 5 0 显徽镜，p o l a r o i d 数玛穗梳，分析软件由重庆天海医疗设备有限公司提供1二、方法2 切片的制作1 及F e u l g e n 染色n 3 1 ：( 1 ) 将固定好的组织标本进行石腊觎埋并匀厚( 4 u m ) 切片。( 2 ) F e u l g e n 染色。采用V a h s 改良D N A 显示法：步骤： 1 切片经梯度酒精复水。【2 入5 N 盐酸水解4 0 分钟( 室温约2 0 。C ) a 【3 直接入S c h i f f 液室
8、温( 约2 0 。C ) 暗处9 0 分钟。 4 】入0 5 偏重亚硫酸钠水溶液洗3 次约6分钟。【5 流水冲洗5 分钟后蒸馏水稍洗。【6 常规脱水、透明、封固。2 2 图像分析、采集：采用细胞图像分析系统对染色后的切片进行分析。以5 5 0 n m 的单色光为光源，每张切片在4 0 倍物镜下，随机选取5 个视野，由数码相机以8 b i t 黑白模式摄入存入计算机内。2 3 图像的测量：图像测量定标为4 0 倍，每个像素点为O 2 0 7 3 I j t m 2 ，以人淋巴细胞核作为D N A 含量标准，其测定值为7 1 8 皮克。对每个图像视野进行设定测量范围、减背底、分割细胞、滤波、删除聚
9、焦不清和重叠的细胞、自动测量等操作，每张切片测量细胞数不少于5 0 个。三、统计分析同第一部分。结栗第一节低温组( 5 1 0 c ) 大鼠骨髓肌和瓣细胞D N A 含量岛P M I 相关性分析一、低温缴骨骼矾和肝细胞D N A 含蓬与P M I 关系酌豳像分析1 。 低温缎死后不阚时间点薅神缀绠细胞的彤态 较( 图2 3 a 、b 、G 、d 、e 、f )从圈2 3 ( p a g e 5 4 ) 看出，随着P M I 的延长，由于细胞自溶，细胞核发生浓缩、碎裂、溶鳃，缨照核凌渍骥逐步交褥横凝不清，数量逐步减少。1 2 低温继两种组织细胞D N A 含量及降解率( 表1 7 、图2 4 )
10、 ：表1 7 餐淦组馨靛觏襄翳缎藏D N A 含量( 毽) ( ；竭及辩解率)注：与死后即剿( 卟) 比较P O 0 5 ) ，肝细胞D N A 含量在3 1 2 h 无恩著差别( P 0 0 5 ) ，其它各时间点均有显藩差别( P 0 ，0 5 ) ，肝细胞D N A 含量程3 , - 9 h 无显著激剐( P O 0 5 ) ，其它各时间点均有显著熬别( P o 0 5 ) ，翳细臌D N A 含爨在3 馥无显装差剐( 玲0 ，0 5 ) ，其它各时闽点均有显薯蓬别( P 。0 5 ) ，其它冬鲑瓣熹均舂驻蔫差裁( P 0 0 5 ) ，其它各时间点均有显著差别( P O 0 5 ) ，
11、其它各时间点均有显著差别f P 中温组，低温组。各估计P M l 与实际P M I 比较，以高温组估计P M I 最为逼近，中、低温组则分别次之，这一结果也表明较高温度比低温度可用来估计P M I 。但利用肌动蛋白含量降解来估计P M I 同时有其缺点，切片的厚度、抗原修复方式、一抗与二抗结合时间及染色时间长短等均是明显影响测定结果的重要方面。这就要求同一实验自始至终做到各个方面的致统一。四、环境温度对组织细胞内A T P 、D N A 、肌动蛋白降解的影响对于死后尸体自溶( 包括细胞D N A 、肌动蛋白的降解) i g 度的各影响因素中，环境温度的高低是重要的影响因素之一。特别是相继出现了
12、几篇有关冰雪中发现百年陈尸的报道后，更加深了我们对温度影响尸体自溶这一理论的理解。从本实验结果第二、三部分的论述可以看出：骨骼肌和肝细胞平均D N A 、肌动蛋白含量的降解高温组快于中温组快于低温组，环境温度越高其与P M I 的相关性越显著，平台期也越短。因此，实验结果进一步证明环境温度影响组织细胞自溶速度，莳温加速组织细胞自溶( 包括细胞D N A 、肌动蛋白的降解) 。尸体组织A T P 含量虽然与自溶关系不大，但与死后短期内存在的超生反应( s u p r a v i t a lr e a c t i o n ) 及尸僵( r i g o rm o r t i s ) 的形成有关。超生
13、反应依赖于A T P 的存在，同时受环境温度的影响，其原理同活体的代谢活动相同。温度高代谢活跃，A T P 消耗快，超生反应时间短，尸僵形成迅速1 30 1 。五、综合多因素估计P M I经过众多法医学者的努力，P M I 的估计越来越逼近精确这一目标。为了避免众多环境因素的影响和局限，法医学者趋向于综合多指标来减少对推断P M I 的影响1 3 7 州。本课题综合大鼠两种组织平均A T P 、D N A 、肌动蛋白含量多个指标，进行了多元回归分析，结果表明综合以上多指标的估计P M I 较单指标的估计P M I 明显更逼近实际P M I 。六、创新及其意义将先进技术应用于法医实践和研究体现了
14、当代法医学研究重在实践的原则。本实验应用目前先进的液体闪烁仪和计算机图像分析仪来分析大鼠骨骼肌和肝组织A T P 、D N A及骨骼肌肌动蛋白含量变化规律来估计P M I ，具有一定的意义。首先，骨骼肌细胞相对于人体其他部位细胞其腐败相对较慢，其细胞内D N A 、肌动蛋白降解慢，较符合实际情况。其次，利用上述两种仪器操作较简单、方便，图像分析还可直接使用普通的石蜡切片“。同时本实验综合多因素进行多元回归统计，有利于更准确地估计P M I 。为将来更广泛地应用于法医实践提供了可能的方泫。但实验取材于动物，其实用价值有待进一步作人尸体研究。结论1 死后大鼠骨骼肌和肝组织A T P 、D N A
15、及骨骼肌肌动蛋白含量与P M I 有显著负相关性。一定范围内依据各自的回归方程可以大致地推断P M I ：依据多元线性回归方程可以较准确地推断P M I 。A T P 适于死后6 小时内P M I 推断。2 两种组织中D N A 及骨骼肌肌动蛋白的降解存在平台期。环境温度升高加速A T P 、D N A 、肌动蛋白降解，缩短后两者平台期。3 死后骨骼肌和肝组织A T P 、D N A 降解快慢有差异。4 A T P 可作为环境温度低时推断P M I 的指标；D N A 及肌动蛋白可作为环境温度高时推断P M I 的指标。参考文献1 A 1 一A 1 0 u s iL M ，A n d e r
16、s o nR A ，W o r s t e rD M ，e t a l M u l t i p l e - p r o b et h e r m o g r a p h yf o re s t i m a t i n gt h ep o s t m o r t e mi n t e r v a l ：l I ，p r a e f i c a lv e r s i o n so ft h eT r i p l e 。E x p o n e n t i a lF o r m u l a e ( T E F ) f o re s t i m a t i n gt h et i m eo fd e a t hi nt h ef i e l d JF o r e n s i cS c i ，2 0 0 1 ，4 6 陀) ：3 2 3 3 2 72 H e n s s g eC D e a t ht i m ee
