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1、石河子大学硕士学位论文外源性uPA在兔椎间盘退变中作用的初步研究姓名：杜文丙申请学位级别：硕士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：刘维钢20100601I摘要 目 的：通过向兔椎间盘内注射不同浓度外源性尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA），观察其对椎间盘的影响，探讨其在椎间盘退变发病过程中的可能作用。 方 法：健康 6 个月左右大白兔 72 只,2.5- 3Kg，随机分为实验组 48 只，阴性对照组 16 只，空白对照组 8 只。实验组：分为三个亚组，采用腰椎侧前方倒八字入路暴露 L4/5 椎间盘，分别注射浓度为10、20、40 ng/l 的 uPA 各 1l。阴性对照组（生理盐水组）：L4/5
2、椎间盘内注射 1l 的生理盐水。空白对照组：不作任何处理。手术后分别于第 3、6 周处死相应各组大白兔取相应椎间盘,进行大体观察、HE 染色、SABC 法测基质金属蛋白酶- 3（MMP- 3）的表达及蛋白多糖含量测定。 结 果:（1）实验组光镜下观察随着时间和浓度增加，纤维环排列逐渐紊乱，髓核含水量逐渐减少，色泽也逐渐浑浊。生理盐水组椎间盘与空白对照组比较没有明显变化，都呈正常外观，纤维环排列整齐，髓核丰富，色泽透亮。HE 染色显示：空白组椎间盘，纤维环仍保持着致密的板层结构，细胞成分较多,呈梭形纤维细胞样或呈软骨细胞样。各实验组随时间和浓度变化：髄核脊索细胞逐渐减少，并逐渐被纤维软骨组织替代
3、，纤维环与髄核之间失去明显的界限。 （2）免疫组化 MMP- 3 表达结果：三周时空白组和生理盐水组，MMP- 3 表达阳性率极低，其余实验组阳性率随浓度增加而增高，各实验组与对照组及实验组之间都有统计学意义（P0.05），其余各实验组与对照组比较有明显差异性（P0.05），其余各实验组与对照组比较有明显差异性（P0.05），其余各实验组与对照组比较有明显差异性（P0.05），其阳性细胞数随着注射uPA浓度的增加而增加，呈浓度正相关，且实验各组之间也有统计学意义。6周时阴性对照组与空白对照组MMP-3表达阳性细胞数比较有差异性（P0.05），而实验组各组MMP-3表达阳性细胞数增加明显，与相应
4、3周各组比较有明显差异性，表现出与时间的正相关。结合本实验结果与已有的文献报道，我们认为椎间盘内MMP-3表达的增高可能是多种影响因素综合作用的结果，但其最为主要的原因是外源性uPA诱发了椎间盘理化性质的改变，进而促使椎间盘软骨大量分泌细胞因子及蛋白降解酶，其中MMP-3含量增加且活性增高， 开始降解软骨中的胶原和蛋白多糖， 它们共同作用， 加速了软骨的降解，减少了软骨的合成， 从而使处于胶原网状结构中的软骨细胞可在基质中自由扩散易于丢失，导致MMP-3进一步增高，形成恶性循环。 3 椎间盘蛋白多糖含量与IVDD的关系 蛋白多糖（ Proteoglycans，PG ）是组成椎间盘的主要成分之一
5、，是维持椎间盘正常结构、代谢和生物力学功能的生化基础，在椎间盘的结构和功能中起着极其重要的作用。蛋白多糖是一种由多肽为主链，以许多氨基多糖为侧链组成的大分子体。PG单体（亚单位）是由包埋于中央的核心蛋白和它两侧的糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG)链组成。GAG占PG分子质量的90%以上，是PG的主要功能基团，主要由透明质酸（hyaluronan，HA）、硫酸角质素（keratan sulphate，KS）和硫酸软骨素（chondroitin sulphate，CS）组成，其中HA含量极低，而以KS和CS为主，由于PG分子中CS和KS的每个双糖单位分别带有硫酸基和/或羧基的负
6、电荷，因此PG不但使椎间盘总离子数大于血浆而形成椎间盘内高渗透压，更能控制带电溶质在组织内的分布和转运。盘内高渗透压能够吸附大量的水分子，是椎间盘抵抗外来压力、吸收震荡、保持黏弹性的生物力学特征和功能的基础31。 同时带电溶质的分布和转运对椎间盘细胞获取营养及排除代谢产物都起到了非常重要的作用8。 本实验采用经典测量蛋白多糖的方法即Bitter法，此法简单，价格低廉，同时数据准确，被广为应用。实验结果表明：1.实验组与空白、阴性对照组相比，蛋白多糖含量明显降低，（P0.05），均有统计学意思。2.实验组相同浓度组结果显示，6周组比3周组其蛋白多糖含量明显降低（P0.05）。3.相同周数不同浓度
7、组之间比较，随着浓度的增加，蛋白多糖含量也呈逐渐降低趋势（P0.05），各组之间有统计学意义。其中，6周外源性 uPA 在兔椎间盘退变中作用的初步研究 2240ng/l组蛋白多糖含量最低，这表明了，uPA-MMP-3系统在兔椎间盘退变过程中可能起着重要的作用，且与时间、浓度呈正相关。可能的机制首先是髓核中PG聚集体的分解而引起水分的丢失。聚集体是由许多单链的透明质酶经特殊相互作用构成，具有凝胶作用。因而，它的分解也可引起一些相关酶释放到基质引起间盘组织细胞变性。文献资料表明：髓核突出时，椎间盘的uPA-MMP-3等能够使蛋白多糖核或蛋白多糖链裂解，产生蛋白多糖降解作用。同时由于胶原修复作用增强
8、， 新胶原形成和代偿活动加强以补充有缺陷的纤维环和髓核。由于变性髓核中型胶原存在，致使其吸收震荡与形变能力降低，髓核硬变程度增加，弹性丧失，失去均匀传递压力作用，导致应力集中到胶原含量低区，引起纤维环破裂，髓核突出。因此， 我们认为，椎间盘退变能够引起PG含量的显著性下降， 反过来PG含量的变化直接反应了间盘退变的病理过程。 测定其含量的变化为该病的病因学诊断提供了可靠的诊断依据， 有着重要的临床实用价值。 综上所述，本实验首次采用微量注射器兔椎间盘内注射外源性 uPA 的方法来研究uPA-MMP-3 系统在椎间盘退变中的作用机制， 通过检测椎间盘 MMP-3 的表达和蛋白多糖含量测定，我们发
9、现随着注射剂量和时间的延长，MMP-3 的表达逐渐增强，蛋白多糖含量逐渐降低，椎间盘的退变呈加重趋势。 外源性 uPA 在兔椎间盘退变中作用的初步研究 23结 论 （Conclution） （1）外源性 uPA 椎间盘内注射法制作的兔腰椎间盘退变模型，在病理组织、形态学等方面的改变与人 IVDD 基本一致，且制造周期较短，制作方法简单，为一种较为理想的 IVDD 动物模型。 （2）随着 uPA 注射浓度的增加以及时间的延长，椎间盘退变程度逐渐加重，说明 uPA在椎间盘退变中起重要作用。 （3）蛋白多糖含量测定能够较好的反映椎间盘退变的程度。 外源性 uPA 在兔椎间盘退变中作用的初步研究 24
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