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1、 HP LC法测定酱油 中的 8种酚酸 胡 华 一， 张惟广 ， 肖昭竞 ， 朱永红 i ( 西南大学食 品科学学院 ， 重庆 ， 4 0 0 7 1 6 ) 2( 重庆市计量质量检测研究 院， 国家农 副加2 1 2 产 品及调味品质量监督检 验中心， 重庆 ， 4 0 0 2 0 0 ) 摘 要 建立 了一种利用高效液相色谱法同时测定 酱油中 8种酚酸的方法。采用 A n g e l a MP C 。 ( 4 6 l il m 2 5 0 m m， 5 m) 色谱柱 ，以甲醇 0 1 磷酸水溶 液作 为流动相进行梯度 洗脱， 柱温 4 0 ， 流速为 1 0 m L m i n ， 进样量
2、 1 0“ L ， 检 测波长 为 2 8 0 n m， 在 此色谱条件下 ， 各 组分 均得到 良好分离。8种组分 的质量浓度 与其峰面积在 1 1 6 mg L 内具 有 良好 的 线性 关 系 ， 相 关 系数 为 0 9 9 9 70 9 9 9 9， 8种 组分 的 平 均 回 收 率 为 8 0 9 2 一1 0 2 7 4 ， 相 对标 准偏 差 为 O 5 8 一3 3l ， 检 出 限为 0 0 10 0 9 mg L。 关键词 高效液相色谱 ， 酚酸 ， 酱油 酱油是 以 富含蛋 白质 的豆 类 和 富含 淀 粉 的谷 类 及其 副产 品为主要 原料 ， 在微 生物酶 的催
3、化 作用 下分 解并 经浸滤 提取 的调 味汁液 。酱油 的组分 复杂 ， 其 中 有机 酸的种类 、 含量 与产 品及 风味 及 质量 密 切 相 关 。 目前 ， 有 关酱 油 中有 机 酸 检 测分 析 的报 道 较 多 ， 所 涉及 的有机 酸 主要 有 乙 酸 、 甲酸 、 丙 酸 、 乳 酸 、 丙 酮 酸 、 琥 珀酸及 富马酸 等 ， 但 未 见有 关 酱 油 中酚 酸 的检 测 分析报 道 。 酚酸属 于酚类 物 质 中非 单 宁化合物 的单体 酚 ， 其 分 子质量小 于 5 0 0 u E 3 。 已有 的研 究表 明 ， 酚 酸不 仅 具有 抗氧化 、 抗 自由基 、
4、抑制 低 密 度 脂蛋 白的 氧化 以 及 预防心血 管疾病 的作 用 ， 而且 还 具 有 抗癌 、 抗 炎 症 和抗 血小板 凝聚 等功 能 。关 于 发酵 食 品 中 酚酸 的 检测 有较 多 报道 ， 李 永 库 等 利 用 固 相 萃 取 检 测 了 葡萄酒 中的 8种酚类 化 合物 ， 刘 群 涛 等 利 用 H P L C 法测定 了啤酒 中 1 0种 酚 酸 ， 而且 酚酸 对 啤酒 风 味稳 定 性具有 一定 的影 响 j 。而作 为酿 造 酱 油原 料 的麸 皮 、 大豆 中有 多种 含 酚酸结 构 的大分 子 物 质 ， 在 发 酵时通 过米 曲霉 等作 用 产生 对 酱
5、 油 风味 具 有 贡献 的酚酸 。研究发 现 酚酸 中的 阿魏 酸 是酱 油 的重要 风 味 物质 4 一 乙基愈 创 木 酚 的前 体 物 ， 发 酵 时 阿魏 酸 可 以通过 脱羧 而 生 成 4 一 乙基愈 创 木 酚 。 因此 ， 开 展酱 油 中酚酸 的检 测 对 于评 估 酱 油 的风 味及 品质 可 能具 有较 大意义 。 第一作者 ： 硕士研究生( 朱永红为通讯作者) 。 重庆市科技攻关 计划项 目( C S T C ， 2 0 0 7 A C 1 0 2 1 ) 和质检 公益性 行业科研专项项 目( 1 01 0 0 ) 稿 日期 ： 2 0 0 90 31 1 ， 改回
6、日期 ： 2 0 0 90 61 5 1 2 2 f 兰 旦 ! Q !： 曼 曼 _ 璺 ( ! ! 旦 ! 呈 鱼 2 本文采用高效液相色谱法 ， 建立了没食子酸 、 阿 魏 酸 、 香 草 酸 、 芥 子 酸 、 丁香 酸 、 绿 原酸 、 对 香豆 酸 、 咖 啡 酸等 8种 酚酸 的检测 方法 ， 同时对 酱油样 品 中 8种 酚酸 的含量 进行 了检测 分析 。 1 材料 与方法 1 1 主 要仪器 与试 剂 L C 2 0 A B高效 液相 色谱仪 ( 配有 S P D 2 0 A V紫外 可见 光 检 测 器 ) (日本 S h i m a d z u公 司 ) ； 没 食 子
7、 酸 ( g a l l i c a c i d ) 、 绿 原 酸 ( c h l o r o g e n i c a c i d ) 、 香 草 酸 ( v a - n i l l i c a c i d ) 、 咖 啡 酸 ( c a f f e i c a c i d ) 、 丁 香 酸 ( s y r i n g i e a c i d )、 对 香 豆 酸 ( p c o u ma r i c a c i d)、 阿 魏 酸 ( f e r u l i c a c i d ) 、 芥 子 酸 ( s i n a p i c a c i d ) 对照 品 ， 均 为分 析纯 ， S
8、i g 一 1T l a 公 司 ； 甲醇 ， 色谱 纯 ， 美 国 T E D I A公 司 ； 磷 酸 、 乙酸 乙酯 、 氢氧化 钠 、 盐 酸 ， 均 为 分 析纯 ， 成都 市科 龙 化 工 试剂 厂 。 标 准溶液 的配 制 ： 分 别称取 没食 子酸 、 阿魏酸 、 香 草酸 、 芥 子 酸 、 丁 香 酸 、 绿 原 酸 、 对 香 豆 酸 、 咖 啡 酸 约 1 6 0 m g ( 按其标示含量折算) ， 用体积分数 1 0 的甲 醇溶 解定 容至 1 0 0 m L以配成混 合溶液 。标 准贮 备液 置于 4冰箱中保存 ， 待用时分别稀释至 l 、 2 、 4 、 8 、
9、1 6 mg L。 1 2实验方 法 1 2 1 样 品来 源及 处理 2个特级生抽 、 1 个老抽购 于食品超市 ； 1个高盐 稀 态 醪液 ( 已成 熟 ) 、 1 个 低盐 固态 酱 醅 ( 已成 熟 ) 分 别取 自酱油厂。其中醪液过滤后保存待用 ， 酱醅加质 量 分数 1 0 盐水 ( 酱 培 与盐 水 比为 1 g ： 1 m L ) 浸泡 2 4 h后 过滤 ， 取滤 液 备用 。 样 品处 理 ： 取样 品 1 mL于 1 0 mL的离 心试 管 ， 加 入 H C 1 ( 1 ： 1 ) 1 mL ，加 入 乙 酸 乙酯 萃 取 3次 ( 每 次 6 m L )充分 混 匀
10、后 进行 离 一 t 7， 合 并 3次 乙 酸 乙酯 提 取 液 ， 加 入 5 0 L N a O H( 4 mo l L ) ， 混 匀 ， 水 浴 蒸 干 ， 加 入 2 mL的 0 2 m o l L的 磷 酸 水 溶 液 溶 解 ， 0 4 5 m 微孔滤膜过滤后进行仪器分析。 1 2 2 色谱 条 件 色 谱 柱 A n g e l a MP C l 8 ( 4 6 m m x 2 5 0 m m， 5 Ix m) ； 流 速 ： 1 0 m L mi n ； 柱 温 ： 4 0 ； 进 样 体 积 1 0 t x L ； 检测波长 ： 2 8 0 n m； 流动相 A为体积分数
11、 0 1 的 磷酸 溶液 ， 流动 相 B为 甲醇 ， 其 洗脱 程序 见表 1 。 表 1 流 动 相 梯 度 洗 脱 程 序 2 结果 与分析 2 1色谱条 件 的选择 2 1 1 检 测 波 长的选择 本 实验 参 照文献 选择 2 8 0 n m作 为 8种 酚 酸 的检 测 波长 ， 所检 测 的 8种 酚 酸 在 2 8 0 n m 下 均 有较 好 的 吸收 。进一 步分 析 发 现 ， 部 分 酚 酸 如 咖 啡 酸 、 对 香 豆 酸 、 阿魏 酸 、 芥子 酸在 3 2 0 n m 下有 更 大 的 吸 收 ， 当对 这 些组 分进行 分 析 时 ， 可 考 虑选 择 3
12、2 0 n m进 行 分 析 检 测 。 2 1 2 流 动 相 选 择 文 献报 道可 以使 用 甲醇一 水 、 乙腈一 水 等作 为流 动 相 分离 酚酸 ， 但 由于 酚羟基 、 羧 基 在水 溶 液 中容 易 发生 电离 ， 极 性增 强 ， 在 固定 相表 面形 成 双重保 留 ， 色 谱 峰拖 尾严 重 。如果 加入 少量 酸性 调节 剂 ， 可使 多酚 的电离受 到抑 制 ， 以 中性分 子 的形态 存在 ， 极 性减 弱 ， 有 利 于增 强在 固定相上 的保 留 ， 使分 离效 果 和峰形 得 到 改善 。酸性 调 节剂有 多种 选择 ， 如 甲酸 、 乙酸 、 三氟 乙酸
13、、 磷 酸等 ， 本实 验 选 择 常 用 的磷 酸 作 为 酸 性 调 节 剂 ， 配成 质量 分数 0 1 磷 酸水 溶 液 ( 流 动相 A) 。分 别采 用 甲醇或 乙腈 作 为 有 机 流 动 相均 可 获得 较 好 的 分离 效果 ， 考 虑到 乙腈 的 毒性 较 大 ， 选 用 甲醇 作 为 有 机 流动相 ( 流 动相 B) 。 2 1 3 洗脱 梯度 优化 本实验 通 过对洗 脱 梯度 的优 化 ， 获得 如表 1 所 示 的梯 度优化 程 序 。该 梯 度能将 难 于分 离 的绿原 酸 、 香 草酸 、 咖啡酸 、 丁香酸进行较好的分离 ， 在该洗脱条件 下 ， 8种 酚酸
14、 的峰 形 和 保 留时 间都 比较 稳 定 ， 各 组 分 均得 到 良好 分离 ( 图 1 ) 。 时间 mi n 1一没 食 于 酸 ； 2一绿 原 酸 ； 3一香 覃 酸 ； 4一咖 啡 酸 ； 5一丁香酸 ； 6一对香豆酸 ； 7一阿魏酸 ； 8一 芥子酸 图 1 8种 酚酸标 准品色谱 图( a检测波长 3 2 0 n m； b检 测 波 长 2 8 0 n m) 图 2为 采用 优 化 的 色谱 条件 对 酱 油 样 品 中 酚酸 组分 进 行分 析 的色谱 图 。 由图 2可 见 ， 酱 油样 品 中可 检 出多 种酚 酸 ， 虽 然 阿 魏 酸 和芥 子 酸 在 2 8 0
15、n m 吸 收 强 度小 ， 但 实验 发现 在 3 2 0 n m 波 长 下 其 吸 收强 度 较 大 ， 而且 能进 行定 性 和定 量分析 。对 同一 样 品进行 多 次 重 复进样 分析 ， 发 现 各 色 谱 峰保 留 时 间非 常 稳定 ， 保 留时 间变异 系数小 于 0 1 ， 有利 于 目标 化合 物 的 定性 定量 分析 。 l U Z U 【 J 时问 mi n 1一没食子酸 ； 2一绿原酸 ； 3一香草酸 ； 4一咖啡酸； 5一丁香酸 ； 6一对香豆酸 ； 7一阿魏酸； 8一 芥 子酸 图 2酱 油 样 品 中酚 酸 色 谱 图 ( 检 测 波 长 2 8 0 n m) 2 1 4 线 性 范 围和 检 出 限 配制 一 系 列不 同浓 度 的 没食 子 酸 、 阿 魏 酸 、 香 草 酸 、 芥 子 酸 、 丁 香酸 、 绿 原酸 、 对香 豆酸 、 咖 啡酸标 准 品 混合 溶液 ， 进 样 1 0 L分 析 ， 以标 准 品 峰 面 积 ( Y ) 对 浓度 ( ，mg L) 进行 线性 回 归 ， 得 到 8种标 准 品 的 回 归方程和检出限( 以信噪比 S N= 3计 ) 见表 2 。 2 1 5 加标 回收率 实验 向 已知酚 酸含 量
