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1、山东大学硕士学位论文符号说明英文缩写英文全称中文译名A C E IA n 百o t e n s i n c o n v e n i n ge I l z y m e 血管紧张素转化酶抑制剂A n gIA n g I IE C MH AL NP C I I IC S B l ID M NE U S AR 认P B SH EE D l = AP NB NT M Bi I l l l l b i t o ra n 昏o c e n s i nI血管紧张素Ia n 西o t e n s i nI I血管紧张素I Ie x t r a c e l l u l a rm a t r i x细胞外基质h y
2、 a l u r o n i ca c i d透明质酸L a m i n i n层粘连蛋白t y p e p r o c o l l a g e nI I I 型前胶原t y p e c o l l a g e n型胶原s o y b e a I lt r y p s i ni I l l l i b i t o r大豆胰蛋白酶抑制剂l l i t r o s o d i m e t h y l a m i n e二甲基亚硝胺E I l z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附法r a d i oi m m u n o
3、 a s s a y放射免疫法p h o s p h a t eb u f f e r e ds o l u t i o n磷酸盐缓冲溶液h e m a t o x y l i na n de o s i ns t a i l l苏木精一伊红染色e t l l y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸p i e c e m e a ln e c r o s i s碎屑样坏死b r i d 昏n gn e c r o s i s桥接样坏死t e t r 锄e t h y lb e n z i d i n e四甲基联苯胺8
4、原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。( 保密论文在解密后应遵守此规
5、定)论文作者签名：导师签名山东大学硕士学位论文糜酶抑制剂对实验性大鼠肝纤维化的影晌硕士研究生张立华专业内科学( 传染病)导师王昌源中文摘要研究背景及目的：肝纤维化是诸多肝病发展为肝硬化的必由之路，也是慢性肝炎、肝硬化等进一步发展恶化的重要原因。其特征是以胶原为主的细胞外基质( E C M ) 因合成增加或和降解减少而在肝内的过量沉积。肝纤维化为一动态的过程，是可逆的。但若肝纤维化进一步发展导致肝小叶结构改变和假小叶形成，即进入肝硬化阶段则难以逆转。目前，临床上尚没有非常有效的抗肝纤维化药物，肝纤维化的预防和治疗在今后一定时期仍是国内外研究的热点及难点问题之一。糜酶是糜蛋白酶的一种，属于丝氨酸蛋
6、白酶，主要存在于肥大细胞的分泌颗粒和细胞间质中。近年来发现肥大细胞激活后可释放糜酶到E C M 发挥如下作用：协同组胺发挥前炎症因子效应；参与胶原酶的激活；参与调节E C M 的形成：促使组织中的血管紧张素I ( A n gI ) 转化为血管紧张素I I ( A n g I I ) 。已有研究显示，糜酶在心脏、肾脏及肺的纤维化中均起重要作用。糜酶抑制剂可改善心脏纤维化。人体肝组织中也有肥大细胞，而肥大细胞中存在着糜酶。初步研究发现肝纤维化程度不同的慢性肝炎患者肝组织中糜酶浓度有明显差异。推测糜酶可能也参与了肝脏纤维化的形成。如果糜酶参与肝纤维化的形成，那么，在肝纤维化发生时给予糜酶抑制剂进行干
7、预，则会减轻肝纤维化的形成而发挥治疗作用。为了证明上述科学假设，进一步证明糜酶在肝纤维化中的作用并为抗肝纤维化治疗寻找新的靶点和药物，我们进行了本项研究。方法：3 0 只雄性w i s t a r 大鼠随机平分为正常组、模型组及干预组。干预组及模型组均腹腔内注射1 二甲基亚硝胺( D M N ) ( 1 0 m 班g ，3 次周，共4 周)山东大学硕士学位论文用作肝纤维化造模；正常组注射等体积生理盐水。干预组同时给予糜酶抑制剂( S B n ) 灌胃( 1 0 m 眺g ，1 次日，共四周) ：模型组及正常组则以等剂量生理盐水灌胃。4 周末麻醉大鼠，取心脏血，称量肝、脾湿重并收取肝组织；苏木精
8、一伊红染色( H E 染色) 和M a s s o n 染色观察肝纤维化的形成；随机抽取样本透射电镜下观察肝细胞超微结构改变；酶联免疫吸附法( E u S A ) 检测血清透明质酸( H A ) 、层粘连蛋白( L N ) 、I I I 型前胶原( P C I I I ) 、型胶原( C ) ；放射免疫分析法( R n ) 测定肝组织内糜酶活性。结果：正常组、模型组和干预组大鼠体重分别为3 2 6 2 1 5 1 昏2 7 9 2 1 5 8 9和3 2 1 6 1 9 3 9 ；肝湿重分别为1 0 6 0 O 9 5 9 、1 2 5 3 1 0 9 9 和l O 9 1 0 5 8 9 ；
9、脾湿重分别为O 9 0 0 0 6 卧1 2 0 O 1 7 9 和1 0 0 0 1 2 9 ；肝、脾指数分别为( 3 2 5 0 2 2，O 2 8 0 0 3 ) 、( 4 4 8 0 2 2 ，0 4 3 0 0 5 ) 和( 3 6 3 0 1 1 ，0 3 1 0 0 3 ) 。与正常组相比，模型组大鼠体重明显降低( 尸 O 0 5 ) ，肝指数明显增加( P O 0 5 、 0 0 5 ) ，b u tl i V e ri n d e xi n c r e a s e dr e m a r k a b l y( 尸 O 0 5 ， 9 9 ) ，天津市化学试剂研究所产品，使用前双
10、蒸水配制成1 1 0 0 m L 的浓度，1 0 m g l 【g 腹腔内注射给药，每日1次，连续3 天，间歇4 天( 即3 次周) ，连续4 周。2 ) 大豆胰蛋白酶抑制剂( S o y b e a n t r y p s i n i n h i b i t o r ，S B T I ) ，A m r e s c o 产品。习牛胰蛋白酶抑制剂( A p r o t i n i n e ) ，A m r e s C 0 产品。4 ) A n gI ( 5 m g ) ，A m r e s c o 产品。5 ) 赖诺普利( 1 i s i n o p r n ) ，M e r c k 产品。6
11、) 乙二胺四乙酸( E D T A ) ，S i 舯a 公司出品。7 ) A 丑gI 放免分析测定盒( 5 0 管) ，北京北方生物技术研究所产品，包括A n gI 标准品( 冻干品) 7 瓶、1 2 5 I A n gI 标记物( 冻干品，红色) 1 瓶、兔抗A n gI 抗体( 冻干品，蓝色) l 瓶、驴抗兔免疫分离剂1 瓶( 2 5 m 1 ) 、A n gI 、A n g I I 缓冲液1 瓶( 4 0 m 1 ) 、A n gI 调节剂1 瓶( 1 5 m 1 ) 、0 3 ME D T A抗凝剂1 瓶( 3 m 1 ) 、0 3 2 M 二巯基丙醇1 瓶( 1 5 m 1 ) 、0
12、 3 4 M8 羟基喹啉硫酸盐1 瓶( 3 m 1 ) 。8 ) 透明质酸( H A ) 酶联免疫测定试剂盒，上海海研医学生物技术中心产品。包括包被酶标板条1 块、标准品( 2 0 0 0 n 咖L ) 1 瓶、标准品稀释液1 瓶、样品稀释液1 瓶、结合物( A ) 1 瓶、浓缩洗涤液( 1 ：2 0 ) 1 瓶、结合物B( 1 ：2 0 ) 1 瓶、酶标抗体( 用时1 ：5 0 ) 1 瓶、酶标抗体稀释液1 瓶、四甲 基联苯胺( m B ) 底物缓冲液1 瓶、终止液1 瓶、坐标纸( 半对数) 1山东大学硕士学位论文张。9 1 层粘连蛋白( L N ) 酶联免疫测定试剂盒，上海海研医学生物技术
13、中心。包括包被酶标板条1 块、标准品( 2 0 0 0 n 咖L ) l 瓶、标准品稀释液1 瓶、浓缩洗涤液( 1 ：2 0 ) 1 瓶、酶标抗体( 用时1 ：5 0 ) 1 瓶、酶标抗体稀释液1 瓶、T M B 底物缓冲液1 瓶、终止液1 瓶、坐标纸1 张。1 0 ) I I I 型前胶原( P C I I I ) 酶联免疫测定试剂盒，上海海研医学生物技术中心。包括包被酶标板条1 块、标准品( 2 0 0 0 n m L ) 1 瓶、标准品稀释液1 瓶、浓缩洗涤液( 1 ：2 0 ) 1 瓶、酶标抗体( 用时1 ：5 0 ) 1 瓶、酶标抗体稀释液1 瓶、T M B 底物缓冲液1 瓶、终止液
14、1 瓶、坐标纸1 张。1 1 ) 型胶原( C ) 酶联免疫测定试剂盒，上海海研医学生物技术中心。包括包被条板1 块、标准品( 2 0 0 0 n 咖L ) 1 瓶、标准品稀释液1 瓶、浓缩洗涤液( 1 ：2 0 ) 1 瓶、酶标抗体( 用时1 ：5 0 ) 1 瓶、酶标抗体稀释液1 瓶、T M B 底物缓冲液1 瓶、终止液1 瓶、坐标纸1 张、封板纸1 张。1 2 ) 中性树胶：中国医药集团上海化学试剂公司出品。1 3 ) 苏木素染液：苏木精2 9 ，9 5 乙醇溶液1 0 0 m l ，溶解后加入钾矾3 9 ，纯甘油1 0 0 m l ，蒸馏水2 0 0 m l 。1 4 ) 伊红染液：伊
15、红1 9 溶于1 0 0 m l9 0 乙醇溶液。1 5 ) P B S 液：P H7 2 、N a C l8 0 卧K C l2 9 、N a 2 H P 0 44 9 、K H 2 P 0 42 4 9 ，加三蒸水至1 0 0 0 m l ，高压蒸汽灭菌后4 保存。配制P B S 工作液：取贮存液5 0 m l 加三蒸水4 5 0 m 1 即成，高压灭菌，4 保存。1 6 ) 其他如乙醇、丽春红、苏木素、甲醛、甲酰胺、磷钼酸、苯胺蓝、醋酸、碳酸氢钠、二甲苯等均为国产分析纯。三、实验仪器1 ) u I T R A C U T E 超薄切片机，德国R E I C H E R T J u N G
16、 产品。2 ) J E M 1 2 0 0 E X 透射电镜，日本日立公司产品。3 1 旋涡混合器，型号：X W 二8 0 A ，上海精科实业有限公司出品。4 ) 隔水式电热恒温培养箱，型号：P Y X D H S ，潍坊医疗器械厂出品。5 ) Y 放射免疫计数器，型号：G C l 2 0 0 ，科大创新股份有限公司产品。6 ) 0 l y m p u s 显微镜，型号：C X 4 0 ，日本0 l y m p u s 公司产品。1 2山东大学硕士学位论文7 ) 超低温冷冻离心机( E p p e n d o r f ) ，型号：c e n t r i f u g e5 4 1 7 R ，德国B e c k m a n公司产品。8 ) 超低温冰箱，型号：M D F U 7 1 V ，日本S a n y o 公司产品。9 ) 普通及低温冰箱，博西华家用电器有限公司出品。1 0 ) 自动双重纯水蒸馏器(
