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1、博士擘位论文人S P L U N C l 基因表达调控机制的初步研究博士研究生：王爽指导教师：姚开泰摘要恶性肿瘤是严重危害人类健康的常见病、多发病。从本质上来说肿瘤是基因病，其发生、发展过程是多种基因表达失常的结果，因此真正意义上的肿瘤治疗也应该、同时也必须是以修正这些发生变化的基因为基点的治疗手段。鼻咽癌( n a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m a 。N P C ) 是我国南方及东南亚地区常见的一类恶性肿瘤。鼻咽癌的发生同其他肿瘤一样，是一个多因素参与和多阶段的过程。为了研究鼻咽癌发病过程中的基因表达变化，何志巍博士通过高密度的c D N A
2、微阵列膜比较了人正常鼻咽和鼻咽癌组织的基因差异表达谱，并从中克隆了一个表达差异具有显著性的E S T 全长，命名为Y H l 基因，G e n e B a n k 收录号为A F l 5 8 7 4 5 。Y H I 基因定位在染色体2 0 q 1 1 2 ，基因全长约7 3 1 k b ，包括9 个外显子和8个内含子；c D N A 含有完整的阅读框架，编码一个富含亮氨酸( 2 4 6 ) 、含2 5 6个氨基酸的偏酸、疏水性蛋白质，有4 个磷酸化位点。由于其3 U T R 剪切方式不同，存在2 种不同的转录本，但编码的蛋白质相同。Y - 1 基因序列与小鼠的上腭、肺及鼻咽上皮克隆( p a
3、 l a t e ，l u n ga n dn a s a le p i t h e l i u mc l o n e ，P L U N C ) 基因高度同源，在猪、牛、大鼠等物种中都高度保守，因而被统一归结为P L U N C 家族；因其分子量小，因此人P L U N C 基因被命名为S P L U N C I ( s h o r t p l u n c1 ) 。S P L U N C l 基因的表达具有相对的组织特异性。在成人鼻咽组织中有较强的表达，而在鼻咽癌细胞系及活检组织中表达下调或不表达；气管组织中的表达中文摘要水平明显高于右心房、空肠、成人肺、唾液腺、胚胎肺组织等。此外，跳狮v c
4、 J基因的一个转录本L U N X 在t N , 细胞性肺癌中表达上调，而且能在该肿瘤的早期转移淋巴结中检测到，因而L U N X 被认为是一个非小细胞性肺癌淋巴结早期转移的分子标志物。S P L U N C I 基因确切的生物学功能至今仍不明确。生物信息学分析显示，该基因编码蛋白的N 端存在一个含1 9 个氨基酸的信号肽，氨基酸序列与腮腺和气管腺上皮产生的分泌蛋白L C N l 和腮腺分泌蛋白( p a r o t i ds e c r e t a r yp r o t e i n ) 极为相似。对该蛋白三维结构的预测结果显示内部含有一个杀菌通透性增强蛋白( b a c t e r i c
5、i d a l p e r m e a b i l i t y i n c r e a s i n gp r o t e i n ，B P I ) 结构域 B P Id o m a i n ) ，其三维折叠结构与B P I 折叠极为相似，而B P I 的桶状结构能与细菌细胞壁上脂多糖特异性的结合，从而具有中和内毒索及直接杀菌作用，因此推测S P L U N C l 蛋白很可能是一种分泌蛋白，并具有结合细菌脂多糖、消灭细菌的功能。此外，对S P L U ，基因的单核苷酸多态性的研究也证实该基因的启动子区多态性与N P C的易感性之间存在着联系，是N P C 发生的一个风险因子。基因表达调控机制是
6、后基因组时代一个重要的研究内容。基因的正确表达依赖于一个复杂的调控机制，主要发生在转录水平。启动子是与R N A 聚合酶特异结合的D N A 序列，是转录起始所必需的顺式元件。在基因表达的调控中，特定的启动子起始过程常常决定某个基因是否应当表达。增强子是基因转录的正调控顺式作用元件，具有促进启动子表达下游基因的作用，同其他的负调控元件和反式作用因子( 转录因子) 共同维护着下游基因的正确表达。不同的转录因子对外界环境的各种刺激或不同发育阶段的各种信号做出反应，结合于转录调控元件，激活或抑制基因的转录，从而控制不同基因的表达。一个基因的正确表达依赖于顺式作用元件、反式作用因子和R N A 聚合酶
7、三者之间的相互协同作用。在阐明基因转录调控机制的基础上，针对性地干预某些转录因子与D N A的结合，逆转基因异常表达，产生抗肿瘤效应，已经发展成为肿瘤治疗的新方法。博士擘住论文基于人S P L U N C I 基因的研究现状及其在肿瘤发病机制和防治中的潜在意 义，本课题的研究目的是明确人体内表达s P 删C J 的细胞类型，鉴定肼Y 眦J的启动子、增强子和有关的转录调控因子，为深入研究S P L U N C l 基因和相关调控机制、构建组织特异性启动子及寻找新的治疗药物和作用靶点奠定基础。本课题进行了如下研究：( 一) 表达S 儿U N C I 基因的细胞类型的鉴定采用原位杂交方法检测近3 0
8、 种组织中S P L U N C l 基因的表达情况，结果显示S P L U N C l 在上腭、表皮、食管及食管一贲门部的鳞状上皮，鼻咽低分化鳞状细胞癌、食管鳞癌和肺鳞癌的肿瘤细胞，鼻咽部、气管、宫颈部化生的鳞状上皮中均不表达；在胃粘膜、胆囊、空肠、结肠、子宫内膜及腺体和宫颈部的单层柱状上皮细胞中也不表达；主要表达在鼻咽、气管和支气管的假复层柱状上皮中，且沿呼吸道从上至下，该基因表达逐渐减弱，在肺组织中检测不到其表达。在腮腺、下颌下腺的导管和浆液腺细胞、鼻咽、肺和食管等部位的粘膜下浆液腺细胞、胃粘膜下壁细胞及乳腺小叶和导管上皮中也表达跳洲C J ，而粘液腺细胞中不表达。此外，在肺、胃、结肠、
9、乳腺、子宫内膜和宫颈等部位的腺癌组织中，S P L U N C l 基因均呈强阳性表达。提示S P L 删C J 基因很可能是一个与分化有关的基因，而非鼻咽癌的抑癌基因，其表达具有明显的细胞特异性。( 二) 生物信息学预测S P L U N C l 基因表达调控元件采用多个生物信息学软件对S P L U N C l 基因5 端5 0 0 0 b p + l O O O b p ( 以第一外显子为+ l 位) 序列进行分析，预测S P L U N C I 的转录起始位点位于1 + l O b p区域问、- 2 9 b p 处存在T A T A b o x 、启动子位于- 4 9 0 + 8 9
10、b p 区间；在人和小鼠两物种间该基因的- 2 4 5 l b p 区间高度保守，并且存在多个转录因子结合位点。这些预测结果为进一步鉴定S P L U N C l 基因的调控元件、探讨其表达调控机制和构建组织特异性启动子奠定了基础，具有一定的参考价值。( 三) S P L U N C l 基因5 端侧翼区启动子活性分析I U中文摘要通过R e a l - t i m eR T - P C R 的方法检测了肺腺癌等十一种细胞系中S P L U N C l 基因的表达水平，结果显示在肺腺癌G l e 8 2 细胞中该基因的表达水平最高，这为进一步研究跳删C ，基因的调控机制提供了合适的细胞材料。在
11、生物信息学预测结果的基础上，以人基因组D N A 为模板，采用P C R 方法扩增了5 端截短的P 4 ( - 3 0 0 0 + 1 0 0 b p ) 、P 3 ( - 2 0 0 0 + 1 0 0 b p ) 、P 2 ( 1 0 0 0 + l O O b p ) 、P 1 ( - 5 0 0 b p + 1 0 0 b p ) 和P 0 ( - 2 4 0 + 1 0 0 b p ) 等5 个调控区片段。预期长度的P C R 产物经过测序证实后，定向连接至报告基因载体p G L 3 B a s i c 的晦珊I 和X k oI 限制性内酶切位点上，经双酶切鉴定后，成功构建了5 个报
12、告基因重组载体p G L 3 - P 0 p G L 3 P 4 。以p S V - p G a l a e t o s i d a s e 质粒为内对照，将空载体p G L 3 B a s i c 、阳性对照p G L 3 C o n t r o l 和不同长度调控区重组质粒分别转染至G l c 8 2 和2 9 3 A 细胞中，培养4 8 小时后检测细胞裂解液中荧光素酶活性。结果显示田矾，c J 基因不同长度调控区片段的荧光素酶活性在G l c 8 2 和2 9 3 A 两种细胞中均存在差异，P o 在2 种细胞中的转录活性均高于其他长度的片段；在两种细胞中，p G L 3 P O 的荧光
13、素酶活性分别是空载体p G L 3 B a s i c 的5 1 0 和2 6 9 倍，说明P O 具有启动子活性，提示S P L 删C J 的启动子可能存在于其5 端序列2 4 0+ l O O b p 区域中。此外，S P L U N C I 基因的5 个调控区片段在G l e 8 2 细胞中的转录活性均高于2 9 3 A 细胞，提示S P L U N C l 基因的启动子具有一定的细胞类型特异性。( 四) 斛吃删C J 基因增强子的鉴定以人基因组D N A 为模板，采用P C R 方法对生物信息学预测的5 个增强子片段( E 0 ：一1 5 8 - - 9 b p ；E 1 ：+ 3 7
14、 7 0 - - , + 3 9 5 9 b p E 2 ：+ 2 0 6 弦+ 2 2 0 1 b p ；E 3 ：+ 2 6 4 5 4 - , + 6 5 5 5 b p ；E 4 ：+ 1 4 5 5 3 - - , + 1 4 6 5 2 b p ) 进行扩增，P C R 产物经过测序证实后，分别定向连接至报告基因载体p G L 3 - P r o m o t e r 中S V 4 0 启动予上游的K p nI和X h oI 限制性酶切位点上和S V 4 0 启动子及报告基因下游的B a m HI 和S a lI 限制性酶切位点上，经酶切鉴定后，构建了5 个报告基因重组载体p G L
15、 3 一E 一妒I V博士学住论文和5 个重组载体p G L 3 F _ 杠4 - d o w n 。以p S V - 3 一G a l a e t o s i d a s e 质粒为内对照，将空载体p G L 3 一P r o m o t e r 、阳性对照p G L 3 - C o n t r o l 和不同增强子重组质粒转染至2 9 3 T细胞中。测量培养4 8 小时后细胞裂解液中荧光素酶活性的结果显示：当增强子片段位于报告基因启动子上游时，p G L 3 - E O 和p G L 3 一E 2 的荧光素酶活性显著增高，调控活性分别是空载体p G L 3 一P r o m o t e r
16、 的2 9 5 和3 0 3 倍。当增强子连接于报告基因下游时，p G L 3 一E 0 、p G L 3 一E 1p G L 3 - P r o m o t e r 之间的差异具有显著性，和p G L 3 E 2 的荧光素酶活性与对照分别是空载体p G L 3 - P r o m o t e r 的2 6 5 、2 8 3 和3 1 3 倍。此外，在增强子位于报告基因不同位置的调控活性比较中，片段E l 位于报告基因下游时调控活性明显高于其位于报告基因上游时的调控活性。( 五) S P L U N C I 基因启动子区反式作用因子的鉴定将S P L U N C I 基因启动子区分别含有S n a i l 、Y Y l 、n - M Y C 和H N F 3 b e t a 转录因子结合位点的寡核苷酸序列( 2 2 3 0 b p ) 进行3 端生物素标记，并退火形成双链的探针，与G I c 8 2 细胞的核提取物进行结合，通过凝胶迁移阻滞实验( E
