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1、一种治疗奶牛乳房炎的生 物制剂的研发与推广 项目编号：07A01主要内容一、选题依据 二、 材料（略） 三、方法与技术路线 四、 结果与分析 五、 讨论 六、 结论一、选题依据 奶牛乳房炎是一种危害极其严重的接触性传 染病该病主要由病原微生物感染而引起。是一种能够导致奶 牛业最为严重经济损失的疾病。根据其有无临床症状可以 将奶牛乳房炎分为临床乳房炎和隐性乳房炎两类，其发病 率根据统计可高达70%，就连国外一些饲养条件和卫生条件 良好的奶牛场中乳区感染率高达75%。目前全世界约有2.2 亿头奶牛，其中约有1/3的奶牛患各种类型的乳房炎。美国 每年因奶牛乳房炎造成的损失达20亿美元。全球每年因乳
2、房炎引起的损失达到350亿美。现阶段控制奶牛乳房炎困境 常用抗生素疗法的缺陷目前对于奶牛乳房炎的治疗主要是抗生素疗法。利用 抗生素控制侵入机体的病原微生物，这种方法的利用， 在控制乳房炎、降低乳房炎的发病率方面,特别是在控 制急性、多发性和亚急性乳房炎方面起到积极的作用。 但是，由于抗生素疗法疗程较长，抗生素被大量应用， 致使一些常见病原菌产生抗药性，耐药菌株大量出现， 使得常用药物疗效下降；同时，大量使用抗生素后，乳 汁中有大量抗生素的残留，直接影响到酸奶的制备，并 可能出现耐药质粒的传递和转移，危害人类的健康。抗 生素疗法无法对遭受到病原微生物破坏的乳腺细胞进行 有效的修复，即使治愈了乳房
3、炎，也无法使奶牛产奶量 得到恢复，而乳房炎引起的损失的70%来自于各种奶牛 乳房炎引起的产奶量下降。 现阶段控制奶牛乳房炎发展方向非抗生素疗法的发展为克服抗生素疗法的缺点，发展出以 下多种控制方法，包括环境控制法、营养 疗法、物理疗法、生物疗法。这些方法各 有优缺点，免疫因子疗法由于免疫因子的 固有可调节免疫的特点是其中非常具有发 展前途的疗法。免疫因子治疗乳房炎的原理1.免疫活性因子能够促进乳腺内细胞MHCII类分子表达，促进抗原递 呈和免疫应答 2.免疫活性因子增强乳腺中巨噬细胞、嗜中性粒细胞的吞噬力和杀菌 力 3.免疫活性因子促进免疫细胞增殖分化，提高细胞毒作用，促进乳腺 免疫应答 4.
4、免疫活性因子对炎症介质进行调控，从而控制乳房的炎症过程 本次实验就是基于免疫活性因子的这些特点 将其应用于乳房炎的治疗之中，以其达到良好 的疗效。研究意义本次实验期望通过经济、来源可靠的原 料制备免疫活性因子，建立起检测其生物活 性的有效方法，测定生物安全性。并将之应 用于临床 ，验证其疗效、残留和对产奶量 的影响。最终的目的在于研制一种经济、有效、 安全的牛乳房炎免疫治疗药物。二、材料（略）三、技术路线 1.免疫活性因子的制备及其安全性和活性 检验（实验室进行） 2.免疫活性因子对奶牛乳房炎的临床治疗 试验 （临床试验推广）免疫活性因子的制备和检验 透析法制备免疫活性因子 理化性质检验 安全
5、性检验 ：毒性检验 、热源检验 免疫活性因子对外周血白细胞数量、吞噬 功能及免疫器官重量的影响 免疫活性因子对奶牛乳房炎的临床 治疗试验 1.用药种类及给药方法分类2.效果分析免疫活性因子制备流程原 材 料挑 选清洗处理剪碎匀浆反复冻融调整Ph值过 滤超 滤无菌检验灌 装动物实验透 析用药种类及给药方法分类 表1 *奶牛厂用药种类及给药方法组别数量患病乳区数用药种类及给药 方法 A11248抗生素A21247抗生素A31243抗生素+活性肽A41245抗生素+活性肽A51247抗生素+活性肽 A61247活性肽A71246活性肽表 2 *奶牛场用药种类及给药方法 表中“”为肌肉注射、“”为乳房
6、灌注；用药剂量为抗生 素每个患病乳区200mg，肌肉注射量为四个乳区用药剂 量之和，患病乳区不足四个的，按照四个乳区用药量给 药。 组别数量患病乳区数用药种类及给药 方 法 B11243抗生素 B21247抗生素 B31245抗生素+活性肽 B41245抗生素+活性肽 B51248抗生素+活性肽 B61247活性肽 B71244活性肽治疗效果评价 通过CMT试剂检测，通过治疗前后数值结 果变化判断乳房炎治愈率。 检测药物残留，鉴定生物安全性 测定产奶量变化，评价其经济性四、结果与分析 1.免疫活性因子制备和检测结果、生物安 全性 2.临床疗效、药物残留、产奶量变化制备产品的的照片1.免疫因子的
7、制备和检测 物理性状得到比重为1.021的淡黄色，有特殊腥味的透明 液体。 理化性质PH为7.0，符合制剂要求；经紫外光谱分析， 该制剂在250nm-260nm处有吸收高峰， A260nm/A280nm=2.28；用二羟基甲苯法测得 核糖含量为33ug/ml；用双缩尿法测的多肽含量 为315ug/ml；无菌检验、蛋白质检验、抗原检 验及过敏实验结果均为阴性。毒性检验结果表3 毒性检验结果 从表结果可以看出，制得的免疫活性因子分别在原液；浓缩2倍、5 倍、10倍；稀释2倍、5倍、10倍的情况下，给小鼠腹腔注射，均无毒 性反应。结论：用3.1.2.1方法制得的免疫活性因子对小鼠无毒性反应 。123
8、4567浓浓度原液浓缩浓缩10倍原液浓缩浓缩 5倍原液浓缩浓缩 2倍原液浓浓度原液稀释释5倍原液浓缩浓缩 10倍生理盐盐水 对对照注射方式腹腔注射腹腔注射腹腔注射腹腔注射腹腔注射腹腔注射腹腔注射 注射剂剂 量0.5ml/10g0.5ml/10g0.5ml/10g0.5ml/10g0.5ml/10g0.5ml/10g0.5ml/10g 毒性反 应应-热源检查结果表4 热源检查结果 结论：制得的免疫活性因子不含热源物质。 组别注射前15min注射后1h注射后2h注射后3 139.80.239.80.339.70.139.60.3 238.90.339.30.337.80.238.40.2 339.
9、70.139.50.239.60.239.70.3 439.80.239.90.239.60.139.80.3免疫活性因子对小鼠血液白细胞数 量的影响表5 免疫活性因子对小鼠血液白细胞数量的影响分析：一次给予机体较大量的免疫活性因子，可以迅速提高机体内免 疫细胞的数目，但是长时间使用，不会使血液内淋巴细胞的数量无限 制的增高。上实验表明结果表明，给与小鼠复方免疫因子以后，血液 中的免疫细胞会出现含量增多的现象，但升至230左右，会出现停顿 现象，在5天内未见其继续升高。分组1d2d3d4d5d6d A1231.21420.91852.12013.02172.12252.4 B1251.3165
10、2.01932.22032.52151.12312.3 C1242.11701.11951.22151.32372.02343.1 D1261.21651.41631.31531.21651.21582.2免疫活性因子对小鼠外周血吞噬性白细胞吞噬功能 及免疫器官重量的影响 表6 免疫活性因子对小鼠外周血吞噬性白细胞吞噬功能及免疫器官重量的影响 分析：连续以不同剂量复方免疫活性因子刺激小鼠5天 后，小鼠外周血白细胞吞噬率明显提高，但机体免疫 器官重量无明显变化。分组吞噬率(%)免疫器官(mg)/体重(g) 脾脏重量胸腺重量 A65.87.920.232.350.32 B57.27.370.342
11、.550.26 C63.57.650.132.550.37 D43.77.820.282.320.422.免疫活性因子对奶牛乳房炎的临床治疗试 验组别组别数量患病 乳区数治疗疗有效 头头数痊愈 乳区数有效 乳区数治愈率（%）有效率（%） A11248882416.766.7 A2124710102221.367.6 A3124512252255.697.8 A4124512221848.995.6 A512471240785.1100 A6124712172836.295.7 A7124612281660.894.6 疗效试验表7 *奶牛厂治疗结果表8 *奶牛场治疗效果表7，8显示，抗生素乳房
12、灌注+复方免疫活性因子肌肉注射组治愈率 明显高于其他各组，有效率达到97.8 %以上，也明显高于其他治疗组 。组别数量患病 乳区数治疗有 效头数痊愈乳 区数有效乳 区数治愈率 （%）有效率 （% ）B112481082018.865.3B2124710122225.572.3B3124512281662.297.7B4124812232051.195.5B5124812381979.297.8B612481223224993.7B7124812271756.389.5药物残留表9 *牛场愈后牛乳中抗生素残留统计 组组 别别第1 天第2 天第3 天第4 天第5 天第6 天第7 天A1+-A2+-
13、A3+-A4+-A5+-A6-A7-表10 *奶牛场愈后牛乳中抗生素残留统计表9、10显示，使用乳房灌注给药的方式用抗生素治疗奶牛乳房炎，第三 天时抗生素残留几乎不可见，而使用抗生素肌肉注射地方法给药，乳汁中 的抗生素残留在乳房炎治愈后的第四天才能消失，复方免疫活性因子和抗 生素的联合应用，对抗生素的代谢没有明显的影响。组别第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天B1+-B2+-B3+- -B4+- -B5+-B6-B7-产奶量统计表11 *牛场治疗过程中及愈后奶牛日平均产奶量统计组别第1天第2天第4天第6天第8天A121.433.5221.454.3621.554.3321.882.852
14、1.936.03A220.533.3220.324.3421. 304.3321. 482.3521.582.03A322.723.4522.863.4323.783.4823.203. 8323.382.33A420.313.3821.333.0921.757.3821.757.3821.834.38A521.627.8223.307.8723.541.3023.023.6323.983.02A620.333.5721.333.2921.757.0821.757.6821.734.58A720.703.5420.863.6221.783.4822. 023.0622.383.32表12 *奶
15、牛场奶牛治疗过程中及愈后日平均产奶量统计表11、12表明，在使用抗生素和复方免疫活性因子治疗奶牛乳房炎的过程 中，患病奶牛的产乳量军有一定的回升，但使用复方免疫活性因子治疗的 奶牛产奶量回升明显，这可能与复方免疫活性因子能够参与受损奶牛乳腺 细胞有关。组别组别第1天第2天第4天第6天第8天B123.973.3224.126. 0324.323.6524.503.4524.896.83B224.733.6924.323.5624.627.5624.883.5724.842.74B326.223.4226.653.8927.594.5127.386.6527. 332.58B423.673.3825.493.7824.764.1825.265.3625.123.63B524.537.7227.477.0827.693.3227.807.3827.343. 47B623.172.2425.067.8425.184.7225
