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1、分析方法验证方案分析方法验证方案 分析方法名称：异烟肼含量测定分析方法 验证文件编号： 分析方法号：中国药典 2010 年版二部页数：1/7验证原因验证原因： 验证类型验证类型：新项目验证 再验证 其它预验证 回顾性验证 转移验证方法描述方法描述：本分析方法为中国药典 2010 版二部方法。为确保其检测结果准确，对该分析方法的专属性、精密度 （系统精密度、方法精密度、中间精密度） 、线性和范围、准确度、耐用性进行评价。验证依据验证依据：中国药典 2010 年版分析方法（295 页）验证时间验证时间：2010 年 07 月 09 日2010 年 07 月 10 日验证项目组成员及职责验证项目组成
2、员及职责：部门成员职责QC仪器设备的确认QC分析方法编写QC分析测试QC数据评估质量部审核批准分析方法验证方案分析方法验证方案 分析方法名称：异烟肼含量测定分析方法 验证文件编号： 分析方法号：中国药典 2010 年版二部页数：2/7验证内容验证内容:-序列号确认测试项目可接受标准01 01. 1 01. 2仪器设备的确认 高效液相色谱仪的确认 天平的确认符合仪器设备的确认要求 符合仪器设备的确认要求02 02.1具体测试内容 系统精密度 配置 1 份异烟肼工作标准溶液，连续进针 6 次，记录异烟肼 峰面积、保留时间。异烟肼峰面积 RSD2.0%,保 留时间 RSD2.0%。异烟肼理 论塔板数
3、大于 4000，拖尾因 子在 0.91.4 之间。02.2方法精密度 平行配制同一批样品的 6 份样品溶液，每份溶液进样 2 针， 计算样品含量及其相对标准偏差。样品含量的 RSD2.0%。02.3线性和范围 以异烟肼工作标准品溶液的浓度为 100%，配制 20%、60%、100%、140%、180%浓度的工作标准品溶液， 每个浓度的标准品溶液进样 1 次，计算出回归方程和相关系 数 R。R0.99902.4准确度 以异烟肼工作标准品溶液的浓度为 100%，取同一批样品，配 制浓度为 80%、100%和 120%的样品溶液各 3 份，每份进样 2 针。计算其回收率。该定量方法的回收率应为 98
4、.0%102.0%。02.5耐用性 配制异烟酸和异烟肼混合溶液，按下列条件改变方法，稳定 后按顺序进样，计算异烟肼的理论塔板数，混合溶液中异烟 酸和异烟肼的相对保留时间 RRT。 a. 改变流速为 0.9ml/min 和 1.1ml/min。 b. 改变柱温为 23和 27。 c. 改变流动相缓冲液与甲醇配比为 83:17 和 87:13。 d. 同一填料不同色谱柱。理论塔板数大于 4000，拖尾 因子在 0.91.4 之间,分离 度 R1.5，相对保留时间 RRT 偏差绝对值不大于 20。03 03.1 03.2 03.3 03.4程序及文件 液相色谱仪校正规程 液相色谱仪操作规程 分析天平
5、校正规程 分析天平操作规程符合要求 符合要求 符合要求 符合要求分析方法验证方案分析方法验证方案 分析方法名称：异烟肼含量测定分析方法 验证文件编号： 分析方法号：中国药典 2010 年版二部页数：3/7验证前准备验证前准备： a)人员培训：培训人姓名培训时间培训内容b)仪器设备、标准品和试剂： 仪器设备仪器名称型号编号校验有效期高效液相色谱仪MODEL200标准品和试剂名称级别厂家批号c)样品名称厂家批号分析方法验证方案分析方法验证方案 分析方法名称：异烟肼含量测定分析方法 验证文件编号： 分析方法号：中国药典 2010 年版二部页数：4/7验证过程验证过程： 色谱条件 色谱条件 色谱柱：a
6、gilent ODS-2 长度：250cm ，内径：4.6mm ，填料 C18 ，填料粒度：5m 检测波长：262nm，带宽 30 柱温：25 进样量：20l 流速：1.0ml/min 流动相 A：0.02mol/l 磷酸氢二钠溶液（用磷酸调 pH 至 6.0） ，流动相 B：甲醇 A:B=85:15 停止时间：12min1.系统精密度 1.1.溶液配制 系统精密度溶液：取异烟肼 10mg，置 100ml 容量瓶中，精密称量，用水溶解并稀释至刻度。 1.2 验证过程及结果 系统精密度溶液连续进样 6 次，记录其异烟肼峰面积、保留时间。 可接受标准：异烟肼峰面积 RSD2.0%,保留时间 RSD
7、2.0%。序号保留时间(min)峰面积123456RSD%结论： 2.重现性试验（方法精密度） 2.1.溶液配制 2.1.1.对照溶液：取异烟肼工作标准品 10mg，精密称量，置 100ml 容量瓶中，用水溶解并稀释至刻 度。 2.1.2.方法精密度溶液：取异烟肼样品 10mg 置 100ml 容量瓶中，精密称定，用水溶解并稀释至刻度。 用此方法配置同一批号的样品溶液 6 份。 2.2.验证程序及结果 工作标准品溶液进 2 针，样品溶液各进 2 针。记录异烟肼峰面积，计算样品含量。 可接受标准：异烟肼含量的 RSD2.0%。分析方法验证方案分析方法验证方案 分析方法名称：异烟肼含量测定分析方法
8、 验证文件编号： 分析方法号：中国药典 2010 年版二部页数：5/7样品批号：峰面积称样量（mg）12平均值含量RSD结论：3.线性和范围 3.1.溶液配制 3.1.1.a 供试品溶液：取异烟肼 50mg，置 100ml 容量瓶中，精密称量，用水溶解并稀释至刻度，混 匀，即得。 3.1.2.线性点溶液：精密移取 a 供试品溶液 5ml、2ml、1ml、分别置 10ml 容量瓶中，用水稀释至刻 度，得到浓度约为 50ug/ml（d 供试品溶液） 、100ug/ml（c 供试品溶液） 、250ug/ml（b 供试品 溶液） 、500ug/ml （a 供试品溶液）的线性点溶液，再精密移取 1ml
9、b 供试品溶液 1ml 置 100ml 容量瓶中，用水稀释至刻度，得到浓度约为 2.5ug/ml（e 供试品溶液） 。 3.2.验证程序及结果 按色谱条件分别对线性点溶液进行分析，每个溶液进样 1 次。以浓度为 X 轴，主峰峰面积平均值为 Y轴，画出线性图，求出回归方程，计算线性相关系数R。 可接受标准：R0.999项目（X1）（X2）（X3）X4）（X5）线性点溶液浓度(ug/ml)异烟肼峰面积线性范围（ug/ml）线性回归方程相关系数R结论： 4.准确度 4.1.溶液配制 4.1.1.对照溶液：取异烟肼 10mg，置 100ml 容量瓶中，精密称量，用水溶解并稀释至刻度，混匀， 即得。 4
10、.1.2.准确度溶液：以对照溶液浓度为 100%，配置 80%、100%和 120%浓度的准确度溶液。即分别 取同一批异烟肼样品 8mg、10mg、12mg 至 100ml 容量瓶中，精密称量，用水溶解并稀释至刻 度。每个浓度的准确度溶液配制 3 份。 4.2.验证程序及结果分析方法验证方案分析方法验证方案 分析方法名称：异烟肼含量测定分析方法 验证文件编号： 分析方法号：中国药典 2010 年版二部页数：6/7按照色谱条件分别对对照溶液和准确度溶液进行分析，每个溶液各进 2 针，按外标法计算准确度溶液 中异烟肼含量，计算其回收率。 可接受标准：该定量方法的回收率应为 98.0%102.0%。
11、回收率 RSD2.0%。样品批号峰面积相应含量称样量 （mg）12平均值实测量 （mg）回收率80100120结论： 5.耐用性 5.1.溶液配制 5.1.1.混合溶液：精密称取 10mg 异烟酸和 10mg 异烟肼样品置 100ml 容量瓶中，用水溶解并稀释至 刻度，混匀，即得。 5.2.验证过程及结果 按下列条件改变方法，原条件溶液和改变色谱条件的顺序进样，计算异烟肼的理论塔板数,拖尾因子。 计算相对保留时间 RRT 偏差绝对值。 a. 改变柱温为 23和 27 b. 改变流速为 0.9ml/min 和 1.1ml/min。 c. 改变 0.02mol/l 磷酸氢二钠溶液(磷酸调 pH 至
12、 6.0)与甲醇配比为 87:13 和 83:17。 d. 选用同一填料的两个不同色谱柱比较 可接受标准：理论塔板数大于 4000，拖尾因子在 0.91.4 之间。分离度 R1.5，相对保留时间 RRT 偏差绝对值不大于 20。条件异烟肼理论塔板数异烟肼拖尾因子原条件0.9ml/mina1.1ml/min23b2787:13c83:17 色谱柱 1 d色谱柱 2分析方法验证方案分析方法验证方案 分析方法名称：异烟肼含量测定分析方法 验证文件编号： 分析方法号：中国药典 2010 年版二部页数：7/7异烟酸条件 RRT偏差绝对值原条件23a270.9ml/minb1.1ml/min87:13c8
13、3:17 色谱柱 1 d色谱柱 2结论： 验证结论验证结论：验证结果见表验证项目可接受标准验证结果判定系统精密度异烟肼的峰面积及保留时间 的 RSD均不大于 2.0。异 烟肼理论塔板数大于 4000。方法精密度RSD不大于 2.0线性和范围线性回归系数 R 应大于 0.999准确度回收率在 98.0-102.0%之间耐用性理论塔板数大于 4000，拖尾 因子在 0.91.4 之间。分离 度 R 大于 1.5，相对保留时间 RRT 偏差绝对值不大于 20偏差及处理：偏差及处理：分析方法验证过程中出现的所有偏差都要记录并有效评估和处理。再验证再验证再验证周期为 3 年。验证负责人/日期审核人/日期批准人/日期
