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1、 刘伟丰 等/蛋白质预算：合成生物学的成本标尺 Chinese Journal of Biotechnology August 25, 2013, 29(8): 11231132 http:/ 2013 Chin J Biotech, All rights reserved Received: May 16, 2013; Accepted: July 1, 2013 Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB721105). Corresponding author: Yong
2、 Tao. Tel: +86-10-64807419 ; E-mail: 国家重点基础研究发展计划 (973 计划) (No. 2012CB721105) 资助。 1123生物工程学报 蛋白质预算：合成生物学的成本标尺 刘伟丰，陶勇 中国科学院微生物研究所，北京 100101 刘伟丰, 陶勇. 蛋白质预算：合成生物学的成本标尺. 生物工程学报, 2013, 29(8): 11231132. Liu WF, Tao Y. Protein budget: cost estimating criteria for synthetic biology. Chin J Biotech, 2013, 2
3、9(8): 11231132. 摘 要: 合成生物学以创建人工生命体系为目的。实践中人们希望人工生命体系具有更强的生产能力、转化能力、环境适应与监测能力，从而获得更优质的生产方式。生命体系的优化涉及到多层次的调控网络，而根本上还是对细胞中蛋白质的含量、定位、活性的控制。在蛋白质表达水平上进行控制是合成生物学元件设计、模块组装以及适配性研究最核心的手段。类似于工厂中的成本计算，合成生物学创建的人工生命体系 (人工细胞工厂) 以蛋白质预算为依据。优化蛋白质预算的研究策略已经成功应用于合成生物学研究实践中。 关键词: 合成生物学，蛋白质预算，蛋白质重组表达 Protein budget: cost
4、estimating criteria for synthetic biology Weifeng Liu, and Yong Tao Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China Abstract: The aim of synthetic biology is to design artificial life systems. Such system is hoped to create a better production process with desired abili
5、ty for bioproduction, biotransformation, adaption and environmental monitoring. However, to design a life system involves understanding the cellular regulation networks at multiple levels, in which the controls of protein level, subcelluar location, and activity are especially critical. Thus tuning
6、protein expression has become essential tools in synthetic biology studies, such as part design, module assembly and compatibility optimization. Protein budget, just like budget for a factory, can be thought as the cost estimating criteria for an artificial cell factory. Protein budget control has p
7、rovided a powerful optimization strategy for synthetic biology. Keywords: synthetic biology, protein budget, recombinant expression 综 述 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech August 25, 2013 Vol.29 No.8 http:/ 1124 “蛋白质预算”是指细胞为了维持正常的生理状态对各种蛋白质的“投入” ，也即表达量上的分配。这既包括细胞表达的全部蛋白质的总体水平，也包括不同蛋白质表达量之间的相互
8、比例。 正常细胞需要维持“蛋白质预算”的平衡。通过对天然细胞蛋白质组的二维电泳等分析可以看出，在特定生理条件下，无论是某种特定蛋白还是细胞的总蛋白，表达量都是处在一个相对恒定的水平。其中对维持生理状态具有重要作用的蛋白质往往具有更高的表达量。当细胞受到外界胁迫时，各种蛋白的表达量会迅速变化并建立新的平衡。部分蛋白表达量的增加会伴随另一些蛋白表达量的减少。 在合成生物学中，功能模块加载后往往会引起人工细胞发生一系列生理变化，造成模块无法正常运行。一个重要原因就是在设计模块时其中的部分酶、蛋白质为了实现功能要求较高的表达量，从而使细胞的“蛋白质预算”失衡。 1 蛋白质与人工生命体系蛋白质与人工生命
9、体系 天然生物体在长期的进化过程中，获得了稳定的生理遗传状态和极强的适应环境的能力。当周围环境及自身生理情况发生变化时，天然生物体会迅速开启应答机制，如对基因表达进行快速的开启或关闭，从而有针对性地产生特定功能蛋白，并关闭不必要蛋白的表达。这种机制体现出了一种“最经济原则” ，可以减少细胞不必要的生理负担，是对自然界长期适应的结果。 在人们对生命现象有了深入的探索和认识后，创建自然界不存在的人工生命体系成为人们对自然改造的目标。在这一目标的驱动下，合成生物学已经成为生命科学中最为活跃、发展最为迅速的研究领域之一1-3。2010 年，美国科学家J. Craig Venter 及其合作者研究将完全
10、由人工设计、改造、组装的一种蕈状支原体 Mycoplasma mycoides 基因组转入到另一种生物山羊支原体Mycoplasma capricolum 的细胞中， 最后获得的合成细胞完全在人工基因组的控制下正常生长4。这标志着人工创建生命体获得了巨大突破。然而合成生物学的最终目标是使人工生命体系比天然生物体具有明显的优越性，例如具有更强的目标产物的生产能力、转化能力、环境适应与监测能力等，从而使人类获得更优质的生产方式。虽然以合成生物学手段设计、合成的人工元件、模块可以赋予人工生命体系某种特定优势的生物学功能，但如何使人工生命体系在各种生理能力上达到乃至超过经过长期自然进化形成的天然生物，
11、仍然是亟待解决的科学问题。 蛋白质是生物体执行生理功能的核心分子。酶、信号分子、细胞通道以及各种水平的调控因子等绝大部分是由蛋白质组成的。生物体之所以能够有效地对各种环境变化进行精准的应答，根本上还是对细胞中各种功能蛋白质的含量、定位、活性的控制。蛋白质能够在时间上和空间上进行准确地表达，有赖于转录、翻译、折叠、修饰及细胞定位等多层次的精确调控。 蛋白质同样是合成生物学创建的人工生命体系的基础。人工生命体系或称人工细胞，是建立在一系列特定功能生物元件和生物模块的基础上的。相关功能元件、模块包括了各种酶催化反应、调控通路。在这些反应和通路中，执行具刘伟丰 等/蛋白质预算：合成生物学的成本标尺
12、1125体功能的绝大多数是酶、调控蛋白等蛋白质分子。因此，元件、模块功能的实现仍然依赖于蛋白质的精确表达。使元件、模块中功能蛋白质的表达能够在时间上和空间上得到精确控制，不仅是合成生物学研究和核心内容，而且对实现人工生命体系的优越性具有重要意义。 2 合成生物学中的蛋白质预算合成生物学中的蛋白质预算 生物元件、模块中包括大量的异源基因表达，采用了各种非天然启动子。因此生物元件和模块本质上仍然是建立在各种蛋白质重组表达单元的基础上。但与基因工程中蛋白质重组表达系统相比，合成生物学中的蛋白质重组表达的调控更为复杂，模块中蛋白质重组表达遵循着特殊的规律，并且需要采用不同的研究、优化策略。 2.1 生
13、物元件、 模块与蛋白质重组表达系统的区别 合成生物学的研究方式是以工程学理论为依据，把生命系统作为工程系统来处理。与传统生物学从 “整体-细胞-分子” 的自上而下 “分解式”的研究方式不同，合成生物学按“元件 (Part) -模块 (Module) -系统 (System) ”的“自下而上”的方式对生命系统进行设计。合成生物学将具有特定功能的调控、代谢途径抽提、模块化，设计标准化和具有通用性特征的基本生物元件，进而组装成大的整合系统。 根据合成生物学的研究过程可以看出，生物元件是合成生物学的基石。合成生物学的首要工作就是对生物元件的挖掘、改造和标准化。生物元件按功能包括启动子、质粒骨架、调控序
14、列、酶等功能蛋白基因编码区等。这些元件本质上都是蛋白质重组表达系统的基本单元。 模块是通过元件有序组装获得的具有特定功能的更高层次的单元，包括合成模块、催化模块、 调控模块等。 模块的功能最终也是通过对酶、调控蛋白等蛋白质的有序表达实现。为了使模块的功能实现最优化，人们常常需要引入异源基因，例如在合成模块中利用异源基因去获得新的合成途径。在满足通量需求等前提下，这些基因的功能通常需要通过过量表达实现。 蛋白重组表达是合成生物学的重要环节，但元件、模块中的蛋白质表达同以蛋白质获得为目的的重组表达系统还是具有明显的区别。蛋白质重组表达系统以获得高水平蛋白为目的。通过重组表达系统表达目的蛋白，既是科
15、学研究中获得蛋白质的主要手段，也是实现功能性蛋白质产品规模化生产的重要途径。蛋白质重组表达系统通常以目的蛋白表达水平最大化为目标，以适应科学研究及工农业生产中获得足够功能蛋白的要求。重组蛋白在细胞总蛋白的比例往往很高，例如大肠杆菌重组表达系统中的外源蛋白可以超过总蛋白的 505。 蛋白重组表达系统包括载体骨架、启动子、终止子等基本组件。为了提高外源蛋白质的表达水平，通常会强化这些组件的功能以有利于增加细胞中目标蛋白的表达滴度。例如在大肠杆菌表达系统中，商业化的载体质粒绝大多数采用松弛型高拷贝复制起始位点 ColE，高拷贝质粒可以通过增加模板的相对数量提高目的蛋白的表达水平6。转录方面则通过采用
16、 T7 等强启动子来增加目标蛋白的模板 mRNA 水平。针对结构基因编码区，通常是通过对外源蛋白编码序列密码ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech August 25, 2013 Vol.29 No.8 http:/ 1126 子的优化，将稀有密码子替换为富有密码子以提高翻译效率7。 但在合成生物学中，虽然元件设计和模块组装仍然包括大量的重组蛋白表达单元，但其最终的功能并非以获得较高蛋白表达水平为目标。合成生物学中的表达单元需要有精确的调控能力，其最终目标是实现一个或多个生物学功能，这需要保证底盘细胞中多个模块间蛋白表达水平的平衡，而非重组蛋白本身的最大化。 2.2 蛋白质预算 (Protein budget) 是合成生物学的“成本标尺” 大量的研究
