盐酸法舒地尔中杂质和二聚体的HPLC法测定

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1、现代药物与临床现代药物与临床 Drugs impurities; dimers; HPLC 盐酸法舒地尔是一种具有广泛药理作用的新型药物，属于5-异喹啉磺酰胺衍生物，对Rho激酶有抑制作用，通过增加肌球蛋白轻链磷酸酶的活性扩张血管，降低内皮细胞张力，改善脑组织微循环，同时可拮抗炎性因子，保护神经抗凋亡，促进神经再生1-2。 临床应用盐酸法舒地尔有时会发生谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GPT）升高，出现皮疹、排尿困难或多尿、嗳气、呕吐，并可出现头痛、发热、意识水平下降和呼吸抑制等不良反应，原因可能与其中的杂质有关。盐酸法舒地尔化学合成过程中的各种中间体和终产物的类似物都有可能成为其杂质，从而

2、影响产品质量和药理活性。文献报道采用RP-HPLC法和紫外分光光度法建立了盐酸法舒地尔注射液中盐酸法舒地尔的分析3-6。 本实验采用超高效液相色谱质谱联用（UPLC-MS）技术鉴定盐酸法舒地尔中杂质，并采用自身对照法测定其总量，同时采用标准曲线法对盐酸法舒地尔二聚体定量，以期为盐酸法舒地尔的质量控制提供参考。 1 仪器与试药 Agilent 1100型液相色谱仪 （配有二极管阵列检 收稿日期：2013-06-19 作者简介：郝全文（1985） ，男（回族） ，吉林省吉林市人，硕士研究生。E-mail: *通信作者 孙国祥 （1962） ， 男， 辽宁凌源人， 教授， 博士生导师， 主要从事中

3、药指纹学研究。 Tel: (024) 23986286 E-mail: 现代药物与临床现代药物与临床 Drugs & Clinic 第第 28 卷卷 第第 4 期期 2013 年年 7 月月 539 测器、四元低压梯度泵、在线脱气装置、自动进样器） 、ChemStation工作站（Agilent科技有限公司） ；Sarturius BS110S分析天平 （北京赛多利斯天平有限公司） ；ACQUITY超高效液相色谱仪、Quattro micro API三重四极杆串联质谱仪、MassLynxTM 4.1质谱工作站软件（美国Waters公司） 。 盐酸法舒地尔 （自制， 批号20110101、20

4、110102、20110103、20110104） ；盐酸法舒地尔二聚体（自制，质量分数为99.8%） ；磷酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20110706） ；甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司，批号20111228031；美国Tedia天地试剂公司，批号20111123） ；磷酸二氢钠（分析纯，广东汕头市西陇化工厂，批号040130） ；庚烷磺酸钠（色谱纯，山东省禹城市中美色谱产品厂，批号20110223） ；水为去离子水。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 用Venusil XBP C18柱（250 mm4.6 mm，5 m） ，甲醇水（5050，含10 mmol

5、/L庚烷磺酸钠和5 mmol/L磷酸二氢钠， 用磷酸调pH 3.0） 为流动相；紫外检测波长为275 nm；进样量10 L；体积流量1.0 mL/min。 2.2 UPLC-MS 检测条件 2.2.1 色谱条件 Waters Acquity Uplctm Beh C18柱（100 mm2.1 mm，1.7 m） ；流动相：水甲醇（7426） ， 等度洗脱20 min， 体积流量0.20 mL/min；柱温40 ；样品室温度4 ；进样量20 L。 2.2.2 质谱条件 离子源：ESI源；检测方式：正负离子同时检测； 扫描方式： 全离子扫描 （SCAN） ；扫描范围：1001 000；毛细管电压：

6、3.0 kV（正离子） ，2.9 kV（负离子） ；锥孔电压：20 V；源温度：110 ；去溶剂气：N2；去溶剂气温度：300 ；去溶剂气体积流量：300 L/h；锥孔气体积流量：30 L/h。 2.3 溶液的制备 2.3.1 盐酸法舒地尔供试品溶液的制备 取盐酸法舒地尔约6 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.6 mg/mL供试品溶液。 2.3.2 盐酸法舒地尔二聚体对照品贮备溶液的制备 取盐酸法舒地尔二聚体对照品约5 mg， 精密称定，置50 mL量瓶中，加适量乙腈溶解后，加流动相至刻度，摇匀，即得0.104 mg/mL溶液。 2.4 UPLC-MS

7、 鉴定盐酸法舒地尔中可能的杂质 取盐酸法舒地尔供试品溶液进样20 L，按以上色谱条件测定，记录色谱图，见图1。可见盐酸法舒地尔有4个杂质。取盐酸法舒地尔5.0 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按以上色谱条件进样10 L测定， 记录UPLC图和总离子流色谱图。按相对保留时间顺序， 在0.088、0.189、1.760、1.978处分别获得m/z 243.0、171.8、222.9、482.1，推测其可能的结构分别为8-氯-异喹啉-5-磺酸、苯磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸甲酯和1,4-二(5-异喹啉磺酰基)-1,4-二氮环庚烷。 1-8-氯-异喹

8、啉-5-磺酸 2-苯磺酸甲酯 3-5-异喹啉磺酸甲酯 4-1,4-二(5-异喹啉磺酰基)-1,4-二氮环庚烷 1-8-chloro-isoquinoline-5-sulfonic acid 2-methyl benzenesulfonate 3-5-isoquinoline sulfonic acid methyl ester 4-1,4-di(5-isoquinolin sulphonyl)-1,4- diazepine 图 1 盐酸法舒地尔及其杂质的色谱图 Fig. 1 HPLC chromatogram of fasudil hydrochloride and its impuritie

9、s 2.5 盐酸法舒地尔中杂质检查 2.5.1 供试品溶液的制备 取盐酸法舒地尔样品约6.0 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，流动相溶解并加至刻度，摇匀。精密量取1.0 mL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 2.5.2 检测限和定量限的测定 取盐酸法舒地尔供试品溶液，稀释成不同质量浓度，进样分析。当盐酸法舒地尔质量浓度为0.36 g/mL时， 峰高约为噪音3倍（S/N3） ，确定盐酸法舒地尔的检测限（LOD）为3.6 ng。当盐酸法舒地尔质量浓度为1.2 g/mL时，峰高约为噪音10倍（S/N10） ，确定盐酸法舒地尔的定量限（LOQ）为12 ng。 2.

10、5.3 精密度试验 精密量取盐酸法舒地尔供试品溶液（批号20110101）10 L，连续进样5次。结果盐酸法舒地尔的峰面积的RSD值为0.7%。 0 10 20 30 40 t /min 1234 现代药物与临床现代药物与临床 Drugs & Clinic 第第 28 卷卷 第第 4 期期 2013 年年 7 月月 540 2.5.4 稳定性试验 取盐酸法舒地尔供试品溶液，在制备溶液后的0、42、84、126、210 min分别进样10 L，进样分析，结果供试品溶液色谱图中杂质总面积随时间增加变化不大，4个杂质峰面积总和RSD值为2.2%，表明杂质在供试品溶液中很稳定。 2.5.5 重复性试验

11、 将盐酸法舒地尔供试品溶液（批号20110101）稀释成6.0 g/mL，进样10 L分析，记录供试液色谱图。重复试验4次。4个杂质总量的RSD值均不大于1.6%，主峰含量均值为98.19%，RSD值为0.03%。 2.5.6 测定 取批号分别为20110101、20110102、20110103、20110104盐酸法舒地尔样品约6.0 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，配制成600 g/mL供试品溶液。精密吸取供试品溶液1.0 mL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得6 g/mL对照品溶液。 精密吸取各供试品溶液和对照品溶液10 L

12、注入色谱仪分析， 记录色谱图。 按自身对照法分别计算各杂质的含量和总杂质的含量，结果见表1， 结果盐酸法舒地尔中4个单一杂质含量的均值不大于1.34%，4个杂质含量之和均值不大于1.38%。 表 1 盐酸法舒地尔中杂质的测定结果 Table 1 Determination of impurities in fasudil hydrochloride 批 号 8-氯-异喹啉-5-磺酸/% 苯磺酸甲酯/% 5-异喹啉磺酸甲酯/% 1,4-二(5-异喹啉磺酰基)-1,4-二氮环庚烷/%20110101 0.015 0.0061 0.032 1.34 20110102 0.016 0.0031 0.0

13、26 1.35 20110103 0.012 0.0031 0.016 1.32 20110104 0.015 0.0075 0.025 1.36 2.6 盐酸法舒地尔中二聚体的测定 2.6.1 系统适用性试验 取盐酸法舒地尔二聚体对照品储备液适量， 稀释， 精密吸取10 L进样分析，记录色谱图，同时进样供试品溶液和空白溶剂，见图2，可见二聚体保留时间为20.6 min，理论塔板数不低于14 000。 盐酸法舒地尔中杂质和盐酸法舒地尔二聚体对照品在线紫外光谱完全一致，证明该杂质是盐酸法舒地尔二聚体，见图3。UPLC-MS也证明其为二聚体。 *-法舒地尔二聚体 *- fasudil hydroc

14、hloride dimmer 图 2 法舒地尔二聚体对照品（A） 、） 、样品（B）和空白溶剂（C）的色谱图 Fig. 2 HPLC chromatograms of fasudil hydrochloride dimer reference substance (A), sample (B), and blank solvent (C) 图 3 盐酸法舒地尔中杂质（A）和二聚体对照品（B）的在线紫外光谱 Fig. 3 UV absorption spectra of impurity (A) and dimer reference substance (B) in fasudil hydro

15、chloride 2.6.2 线性关系试验 取盐酸法舒地尔二聚体对照品储备液适量， 分别稀释成0.63、2.08、4.16、10.40、20.80、41.60 g/mL溶液。精密吸取上述溶液10 L注入色谱仪分析，测定两次，记录色谱图，用平均峰面积对质量浓度回归,得方程A14.319 C2.292，r0.999 9，线性范围：0.6341.60 g/mL。 2.6.3 检测限和定量限试验 以S/N10确定定量限为6.24 ng，以S/N3确定检测限为2.52 ng。 2.6.4 精密度试验 精密吸取盐酸法舒地尔二聚体对照品贮备溶液10 L注入色谱仪，连续进样分析5次，记录色谱图，结果二聚体峰面积的RSD值为1.2%。 2.6.5 稳定性试验 分别在配制盐酸法舒地尔供试品溶液后的0、52、104、150、285 min进样分析，200 250 300 350 400 /nm BAA0 5 10 15 20 25 t /min BC* * 现代药物与临床现代药物与临床 Drugs & Clinic 第第 28 卷卷 第第 4 期期 2013 年年 7 月月 541 记录色谱图， 结果二聚体峰面积的RSD值为1.4%，结果表明二聚体溶液在285 m