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1、小鼠窦前卵泡的最佳共培养方法探小鼠窦前卵泡的最佳共培养方法探讨讨 卵泡是卵巢内的基本功能单位，包含一个卵母细胞、颗粒细胞及膜细胞1。卵泡膜间质细胞 ( theca interstitial cells，TIC) 是卵巢中除卵泡外具有分泌雄激素功能的间质细胞，它在卵泡的生长发育、闭锁过程中发挥着多种重要作用2 4，同时作为卵巢微环境的主体成分之一，TIC 参与了卵巢衰老5及多囊卵巢综合征等卵巢相关疾病6的发生发展。为了能够进一步深入研究 TIC 对卵巢功能的影响及其作用机制，在体外构建一个可最大程度模拟体内环境下卵泡与 TIC 相互关系的共培养模型是十分有意义的。目前卵泡的培养主要包括二维法和三
2、维法， 而共培养方法包括直接接触式和非直接接触式。 本研究拟采用海藻酸钠凝胶 ( alginate hydrogel，ALG) 和 Transwell 构建 3 种共培养模型，从卵泡的形态观察、 生长发育、 存活率、 激素分泌水平和减数分裂恢复情况等方面进行综合评价，旨在探索一种最佳的共培养方法。 1 材料和方法 1. 1 实验动物 由武汉大学动物实验中心提供 SPF 级 C57BL/6 小鼠，动物处理过程遵守动物保护与使用原则，并获华中科技大学同济医学院动物保护委员会批准。 1. 2 主要试剂 Lebovitz s L 15 培养基( Invitrogen) 、 MEM 培养基 ( Hycl
3、one) 、注射用重组人促卵泡激素( Merck serono) 、FBS( Gibco) 及 hCG( 赤峰博恩药业有限公司) ，其他试剂均购自 sigma 公司。 1. 3 卵泡膜间质细胞的分离与培养 分离 21 25 日龄 C57BL/6 雌鼠的卵巢，针刺以尽量多地释放出卵泡中的颗粒细胞。将残余组织充分剪碎后用消化液( McCoys 5a 培养基 +4 mg/ml 胶原酶 +10%胎牛血清) 37消化 1 h，每 15 min 吹打 1 次。将消化好的细胞 悬 液 进 行 离 心 ( 1 000 rpm，5 min) ，并 用 McCoys 5a 培养基清洗 1 次。最后所得的细胞用 T
4、IC 培养基 ( McCoys 5a 培养基 +10% 胎牛血清 +100 IU/ml 青霉素 + 0. 1 mg/ml 链霉素) 重悬，接种于 24 孔板或 Transwell 滤膜 ( Corning，#3422) 底侧面 ( 倒置于 12 孔板中) ，每孔细胞数约为 1 105 个，置于 37 、95% O2 5% CO2 培养箱中培养 24 h，细胞贴壁后将 Tranwell 按正常位置置于 24 孔板中，加入 TIC 培养基。 1. 4 窦前卵泡的分离 用 29 号胰岛素针针头针刺 14 16 日龄 C57BL /6 雌鼠的卵巢，分离得到窦前卵泡，置于维持液 ( MEM 培养基 +1
5、%FBS +100 IU/ml 青霉素 + 0. 1 mg/ml 链霉素) 中，37、95% O25% CO2 培养箱中孵育 30 min。选择具备以下特征的健康卵泡用以下一步包埋或培养: 直径在 110 140 m之间; 具有完整连续的基底膜，无明显因操作造成的卵泡损伤; 卵泡中央可见一个未成熟的卵母细胞; 无明显窦腔形成。 1. 5 卵泡与卵泡膜间质细胞的共培养 1. 5. 1 海藻酸钠凝胶法 将卵泡膜间质细胞接种于 24 孔板底部，孵育过夜，更换卵泡生长培养基 ( MEM 培养基 + 10%FBS +ITS +10 mIU/ml FSH +100 IU/ml 青霉素 + 0. 1 mg/
6、ml 链霉素) ，600 l/孔。将 5 个窦前卵泡转移至 2% ( w/v) 无菌海藻酸钠液珠中，充分浸入包埋液 ( 50 mM CaCl2+ 140 mM NaCl) 中交联 2 min 形成凝胶， 再将海藻酸钠胶珠置入 24 孔板内，记为共培养第零天。 1. 5. 2 Transwell 间接接触法 将卵泡膜间质细胞接种于 24 孔板底部，更换 500 l 卵泡生长培养基，放入 Transwell 小室，加入 100 l 卵泡生长培养基，直接吸取 5 个卵泡转移至上室内。 1. 5. 3 Transwell 直接接触法 将培养于 Transwell 小室底侧面的卵泡膜间质细胞置于 500
7、 l 卵泡生长培养基中，直接吸取 5 个卵泡转移至含 100 l 卵泡生长培养基的上室内。 1. 5. 4 培养基更换 每组包含 20 30 个卵泡，于 37 、95% O2 5% CO2 培养箱中培养 6 天，隔天半量更换新鲜配制的卵泡生长培养基，收集培养基冻存于 80，用于激素检测。 1. 6 评价方法 1. 6. 1 卵泡形态、直径、存活率监测7: 从第 1 天开始，隔天用倒置相差显微镜观察卵泡形态并拍照，用 ImageJ 软件测量卵泡直径 ( 取长轴和短轴的平均值) 。通过观察卵泡形态判断是否存活，将具有以下特征的卵泡视为死亡卵泡: 卵泡或卵母细胞碎裂、皱缩，尺寸缩减; 卵母细胞不再由
8、颗粒细胞层包绕; 颗粒细胞变暗或碎裂。 1. 6. 2 激素分析 收集共培养第 2、4、6 天 1 /2 的培养基冻存于 80冰箱，用直接化学发光法测定睾酮、雌二醇。 1. 6. 3 卵母细胞的减数分裂能力评价7 8: 培养结束后，用含 10IU/ml 海藻酸钠裂解酶的 MEM 培养基替换原有的培养基，在 37、95% O2 5% CO2 培养箱中孵育30 min。将卵泡从裂解的海藻酸钠凝胶中转移至成熟培养基 ( maturation medium: MEM 培养基 + 10% FBS + 5 ng/ml EGF + 1. 5 IU/ml hCG +100 IU / ml 青霉素 + 0. 1
9、 mg / ml 链霉素) 中，在 37 、95% O2 5% CO2 培养箱中孵育 16 20 h，进行体外成熟 ( IVM，in vitro maturation) 。然后用 0. 3% 透明质酸酶处理卵泡，并用吸管轻轻吹打，使卵母细胞从卵泡中裸露出来。 观察卵母细胞并按以下方法进行分类: 生发泡期 ( GV， germinal vesicle) : 卵母细胞在 hCG 的作用下未恢复减数分裂，可见卵母细胞的细胞核持续存在; 生发泡破裂期( GVBD) : 卵母细胞核膜消失， 生发泡不可见; 减数第二次分裂期( MII， metaphase II) : 卵母细胞恢复减数分裂，停滞在减数第二
10、次分裂期，在卵母细胞周围可见第一极体; 退化( DG，degenerated) : 卵母细胞碎裂或皱缩。 1. 7 统计分析 所有实验均独立重复 5 遍以上，运用 SPSS 18. 0 统计软件进行数据处理与分析，计量资料采用 ( x s) 表示，卵泡直径、激素水平的组间比较采用单因素方差分析 ( ANOVA) ， 卵泡存活率和减数分裂阶段采用 2 检验， P 0. 05 表示有统计学差异。 2 结果 2. 1 3 种共培养方法下卵泡的生长发育 海藻酸钠凝胶包埋的卵泡在体外培养的 6 天中始终维持了卵泡的三维结构，并可以清晰观察到卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞 ( 图 1A C) 。培养结束时
11、可以观察到处于偏心位置的卵母细胞，部分卵泡的卵母细胞周围可见窦腔形成，而在 Transwell 中培养的两组，镜下观察到卵泡结构较不清晰，颗粒细胞与卵泡膜细胞的分界不清，在培养到第 3 天开始，卵泡内的颗粒细胞开始贴壁生长，卵泡直径急速增加，培养到第 5 天时，部分卵泡的颗粒细胞向外扩散增殖，导致卵泡结构的破坏，而这种现象在海藻酸钠凝胶法中的发生率很低。在 3 种共培养方法中，卵泡的生长发育均呈现出两个阶段 ( 图 2) : 培养第 5 天前，卵泡生长缓慢，之后卵泡则开始加速生长。在起始卵泡直径控制在 110 140 m 的前提下，在培养的第 1 天、第 3 天各组间卵泡直径均无统计学差异 (
12、 P 0. 05) ， 卵泡存活率也无统计学差异 ( 分别 为 91. 1%、 89. 1%、88. 2% ) ，见表 1。在培养到第 5 天时，海藻酸钠凝胶法的卵泡生长加速幅度明显低于 Transwell 内的两组，使得三维培养的卵泡直径小于 Transwell 内的卵泡 ( 180. 3 39. 6) 、 ( 209. 4 59. 3) 、 ( 226. 4 62. 6) m，P 0. 05，而 Transwell 直接接触法和间接接触法之间无统计学差异。第 5 天的卵泡存活率也出现差异，海藻酸钠凝胶法 ( 77. 3%) 和 Transwell 直接接触法 ( 76. 5%) 要高于 T
13、ranswell 间接接触法( 57. 4%) ，P 0. 05，海藻酸钠凝胶法和 Transwell 直接接触法之间无统计学差异。【表 1】 2. 2 激素分泌 3 种共培养方法中，睾酮的分泌水平在第 2、4、6 天均逐渐升高，且各组间无明显差异( 图 3) ，而雌二醇水平在 3 组中的分泌情况与相应卵泡的直径增长情况相一致。第 2 天和第 4 天，3 组间均无统计学差异，但到第 6 天，Transwell 间接接触法( 2 752. 4 341. 6) pg/ml 和 Transwell 直接接触法 ( 2651. 0 318. 9) pg / ml 中雌二醇的分泌量明显高于海藻酸钠凝胶法
14、 ( 1 097. 6 34. 0) pg/ml，P 0. 001，Transwell 间接接触法和 Transwell 直接接触法之间无统计学差异。 2. 3 体外成熟 ( IVM) 后卵母细胞减数分裂恢复情况 在体外培养 6 天后， 选择镜下观察形态完整的存活卵泡进行体外成熟。 在海藻酸钠凝胶法中 66. 7%的卵母细胞能够恢复减数第一次分裂，其中 17. 3%能够排出第一极体恢复减数第二次分裂， 而 Transwell 间接接触法和 Transwell 直接接触法的 GVBD 率分别为 64. 2%、66. 7%，MII 率分别为 14. 0%、6. 0%。3 组间在 GV、GVBD、M
15、II、DG 的比例上均无统计学差异，见表 2。【表 2】 3 讨论 海藻酸钠凝胶是近年来应用比较广泛的卵泡三维培养材料， 在小鼠模型中可成功培养出活的、健康的、并能产生后代的卵泡，卵泡和卵母细胞均能生长达到与在体发育相似的直径9，而且颗粒细胞可进行增殖，分泌雌二醇、孕酮、雄烯二酮至周围培养基中。通过共培养方法，能够将卵泡体外培养的起始阶段提前至早期次级卵泡，甚至初级卵泡。如与胚胎成纤维细胞 ( MEFs)7进行共培养，这种常用于促进胚胎干细胞未分化生长的饲养细胞能够提供卵泡存活和生长所必需的关键旁分泌因子，从而使得早期次级卵泡 ( 平均直径为 90 100 m) 和初级卵泡 ( 平均直径为 7
16、0 80 m) 得以在体外生长至 251 347 m，形成窦腔，获得较高的存活率 ( 分别为 70% 和 23% ) ，而且大多数的卵泡能够恢复减数分裂。有学者10利用卵巢间质细胞 ( 主要成分为膜细胞和卵巢巨噬细胞) 作为饲养细胞，模拟小卵泡在体内的环境，提高雄激素的生成，补充缺乏的细胞因子，显着促进了初级卵泡和早期次级卵泡的生长和存活。此外，在其他物种中，如水牛的大窦前卵泡与多种卵巢体细胞 ( 如卵丘细胞、颗粒细胞、卵巢间充质细胞、输卵管上皮细胞) 进行直接共培养也获得了成功11。 Transwell 小室是一种多用途的带有多微孔膜的通透性支持物，可以允许细胞从其基底面和顶面分泌和吸收分子， 使得细胞可以在更为自然的极性条件下生长， 同时还提高了细胞的分化水平，使得体外生长的细胞在形态和功能上更为接近体内的细胞。Eppig 等人12用两步法体
