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1、糖皮质激素诱导血液系统肿瘤细胞凋亡机制的研究进展糖皮质激素诱导血液系统肿瘤细胞凋亡机制的研究进展【摘要】：糖皮质激素(Glucocorticoid,GC) 具有促凋亡和抗增殖的作用，目前广泛应用于血液系统恶性肿瘤的化疗，其诱导的细胞凋亡过程复杂，目前认为可分为三个阶段：起始阶段，包括 GR 介导的基因调节；决定阶段，包括生存前和凋亡前因子的抗平衡反应；执行阶段，包括 caspase 和内源性核酸酶的活化。现依据此三个阶段对糖皮质激素诱导血液系统肿瘤细胞凋亡进行综述。【关键词】：糖皮质激素，血液肿瘤，凋亡，机制糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)是重要的皮质类固醇激素之一，目前作为一
2、种重要的联合化疗药物广泛应用于血液系统恶性肿瘤。除了直接用于非实体性肿瘤如淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤的化疗以外，糖皮质激素还可用于处理肿瘤相关的水肿、炎症、疼痛、电解质失衡、恶心、呕吐等临床症状，是化疗不可缺少的一部分。GR 诱导肿瘤细胞凋亡是一个复杂的过程，目前认为可分为三个阶段：起始阶段，包括 GR 介导的基因调节；决定阶段，包括生存前和凋亡前因子的抗平衡反应，具体为前凋亡蛋白 Bim 表达升高、核转录因子 AP-1、NF-B 与 GR 的相互作用、C-myc 表达失调等；执行阶段，包括 caspase 和内源性核酸酶的活化。一、糖皮质激素受体的结构与亚型糖皮质激素受体是保守的核受体超家
3、族中的一员，属于核转录因子。经典的GR由约800个氨基酸构成的多肽组成，其一级结构可分为N末端和C末端及3个独立的功能区。N末端和C末端的转录激活功能区AF-1和AF-2可控制靶基因转录；3个独立的功能区包括：激素结合区（hormone-binding domain，HBD），DNA结合区（DNA-binding domain，DBD）和免疫原区（immunogenic domain，ID）。其中HBD位于COOH端，主要功能包括：与激素配体结合，参与糖皮质激素受体二聚体形成；可与热休克蛋白（hot shock protein，HSP）结合；其序列内含有其他转录因子如AP-1的作用位点及核转位
4、信号的核定位序列。DBD位于糖皮质激素受体蛋白的中部，负责与靶基因启动子或增强子上的糖皮质激素反应元件（glucocorticoids response element，CRE）结合；ID位于NH2端，具有特异性抗原活性，含有多个可磷酸化的丝氨酸和苏氨酸位点，与糖皮质激素受体的磷酸化和脱磷酸化有关，并参与糖皮质激素受体的反式激活作用。根据糖皮质激素受体在细胞上的分布部位，可将GR分为细胞内受体(iGR)和膜受体(mGR)。1 糖皮质激素细胞内受体（iGR）：人的iGR有四种亚型：GR-、GR-、GR-和GR-。其中，GR-是80年代中期克隆的第一个类固醇激素受体，是一个配体依赖的转录因子，也是
5、胞质内含量最多的GR异构体(约占总GR的71)1，主要由3个不同的功能域组成：N末端是非配体依赖的活化功能域-1(AF-1)，可与其他转录调节因子相互作用，与基因的转录活化密切相关；受体中部是序列高度保守的DNA结合区(DNA binding domain,DBD)，包含两个锌指结构(zinc fingers)，在受体二聚体的形成中起关键作用；C末端是配体结合区(1igand binding domain, LBD)，包含配体依赖的活化功能域-2(AF-2)和核定位信号，该区也是热休克蛋白结合处，参与受体的核转位以及与转录因子AP-1和NF-B等的相互作用2。而GR位于胞核，不能结合GC，也没
6、有转录激活作用，多项研究3表明GR能以浓度依赖的方式抑制GR-的效应，且在炎症反应中诱发糖皮质激素抵抗，其作用机制可能是竞争性结合GRE靶点，由此推测GR可能是GC作用的一个内源性抑制剂。糖皮质激素膜受体（mGR）：mGR是存在于多种细胞膜上的糖皮质激素另一种形式的受体，在糖皮质激素的快速效应及诱导某些细胞凋亡等过程中发挥重要作用。糖皮质激素除了有经典的基因组效应外，还可能通过非基因组效应产生作用，非基因组效应包括经典非基因组效应和非经典非基因组效应，经典非基因组效应可能与其相应细胞膜受体mGR结合后，通过第二信使（Ca2+、IP3、cAMP、PKC等）介导的信号转导通路，促发一系列与基因调节
7、相关或不相关的胞内效应。而非经典非基因组效应可能主要通过与细胞膜的直接物理化学反应介导。二、糖皮质激素诱导血液系统肿瘤细胞凋亡机制1 起始阶段：GR介导的基因调节在激素不存在的情况下，GR-可以与HSP90、HSP70、HSP40、低相对分子质量蛋白P23及亲免素(immunophilin)等胞浆蛋白结合，形成非活性复合体存在于胞质中，这个复合体基本上处于解离以及ATP和HSP-70依赖的重新组合这种固定循环中，这种循环有利于GR蛋白保持在非激活状态，直到配体激活为止。GR-与配体结合后，引起HSP等分子伴侣的解离，暴露出的核定位信号使得活化的GR-迅速转位到核内，然后通过同源二聚化形成同源二
8、聚体，进入细胞核特异性结合靶基因启动子/增强子区域的糖皮质激素反应元件(glucocorticoid response elements，GRE)，GRE的共享序列是一段大小为15个碱基的核苷酸序列：AGAACAnnnTGTTCT(n为任意碱基)，结构上具有不完全回文特征4,GR-GC复合物同GRE作用时，GR二聚体中的两个DNA结合区分别与GRE回文结构中的半位点（half site）结合，即受体二聚体通过与GRE回文结构的非特异性结合达到与DNA相互作用的目的，这种结合导致多种辅激活因子募集到GR-DNA 复合物上，发挥相互协同作用从而促进靶基因转录5。GR-也可与其他转录因子(如AP-l
9、、NF-B) 发生蛋白-蛋白相互作用，直接或间接调节凋亡相关基因的转录，改变细胞本身的生存和凋亡动态平衡，最终导致细胞凋亡6。但GR在肿瘤细胞内的活化可能有异于上述途径,Catts等证实，将野生型儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞暴露于地塞米松或细胞毒制剂中，可导致GR从胞质向核内移位。因而可以推测在ALL细胞中可能有不依赖配体的GR活化。2 决定阶段:生存前和凋亡前因子的抗平衡反应2.1前凋亡蛋白Bim表达升高诱导肿瘤细胞凋亡前凋亡蛋白Bim最初是通过筛选小鼠的噬菌体cDNA表达文库获得的一种与Bcl-2相互作用的蛋白,在多种正常细胞包括造血细胞、上皮细胞、神经细胞以及生殖细胞中均有表达,
10、是Bcl-2家族促生存成员的死亡配体，主要通过线粒体途径激活BaxBak诱导细胞凋亡7。目前已发现Bim存在11种异构体(BimEL、BimL、Bims、Bim7、Bim、Bim、Bim、Bim、Bim、Bim12123、BimAD)，其中BH3结构域决定了Bim分子的促凋亡活性，是其与同源的Bcl-42蛋白相互作用的结构基础。血液系统肿瘤细胞中，Borensztajn 等8证明了凝血因子 Xa 通过 BH3 结构蛋白 Bim 的上调诱导肿瘤细胞凋亡,Ploner 等9发现足够剂量 DEX 可使Bims、BimL、BimEL 在 T、B 淋巴瘤细胞开始凋亡的时刻被诱导,且在没有其他凋亡信号存在
11、下 Bim 高表达足以诱导敏感的急性淋巴细胞性白血病细胞凋亡，证实 Bim 可直接激发地塞米松诱导的凋亡。Lglesias-Serret 等10用 siRNA 干扰人前 B 细胞 Bim mRNA，24 h 后 Bim 基础表达较对照组明显下降，从而诱导了该细胞对糖皮质激素(GC)的抵抗，此时干扰 Bcl-2 mRNA 使其表达减少却不能逆转对 GC 的抵抗，说明 GC 诱导 Bim 蛋白表达上调是 GC 诱导前 B 细胞凋亡反应中的必需信号，与 Bcl-2 的浓度无关。Bachmann 等将儿童 B 细胞急性淋巴细胞白血病的骨髓活检物移植于 NODSCID 小鼠，发现复发及初治的对 GC 不
12、敏感患儿的细胞能耐受高浓度地塞米松，但其糖皮质激素受体蛋白表达水平和 GC 敏感组一致；GC 敏感组地塞米松作用 8h 后，Bim 表达显著增高，而 GC 耐药组 Bim 表达未上调。这表明急性淋巴细胞白血病复发患者及初治对 GC 不敏感患者的细胞GC 抵抗发生在 Bim 被诱导的上游，从而提示 GC 诱导的 Bim 表达上调是 GC 敏感的急性淋巴细胞性白血病细胞凋亡的重要机制，而 GC 作用后 Bim 表达无上调或上调不足可能是 GC 耐药的重要原因11。赵亚宁等进一步研究认为 DEX 诱导 Bim表达是通过 GC-GR 细胞内信号转导途径介导的，P38-MAPK 信号途径也参与 DEX诱
13、导的敏感细胞 Bim 表达的调控。但也有研究表明，在原发性成人淋巴细胞白血病病例中，Bim 的上调在 GC 敏感的样品比在 GC 抵抗的样品中更复杂 ，这一结论可通过以下观测结果加以解释：即 Bim 是 GCs6 的间接靶点，并取决于Fox03 转录因子的充分活化，AktPKB 可磷酸化 Fox03 来抑制其活性，而AktPKB 是在 GC 抵抗细胞中经常被活化的一种蛋白激酶 。2.2 AP-1与GR的相互作用 激活蛋白AP-1是一类重要的转录调节因子，由两个分别属于Jun家族(c-Jun、v-Jun、Jun-B、Jun-D)和Fos家族(c-Fos、Fos-B、Fra-l、Fra-2)的蛋白
14、通过亮氨酸拉链形成的同源或异源二聚体。c-Fos-c-Jun 是细胞中最普遍的AP-1存在形式,炎症细胞因子通过诱导Jun N-端激酶(JNK)磷酸化c-Jun，促进Jun家族和Fos 家族形成二聚体，形成活化的AP-1。研究表明，糖皮质激素活化的GR-以其配体结合域(LBD)与JNK直接结合，使MKK7-JNK复合物解离，抑制MKK7通过磷酸化方式激活JNK,使c-Jun不能被JNK磷酸化,导致AP-1活化下游基因转录功能显著下降。Olivier等12利用酵母双杂交技术，以GR突变体作为诱饵蛋白，发现甲状腺受体作用蛋白6(TRIP6)可与GR直接结合,TRIP6的细胞核亚型(nuclear
15、TRIP6, nTRIP6)是AP-1 和NF-B 的辅激活因子,而当GR与nTRIP6结合后，nTRIP6成为辅阻遏因子，抑制AP-1 和NF-B 的转录活性。2.3 GR与NF-B的相互作用NFB最初是由Sen等在B淋巴细胞核提取物中发现的一种核蛋白，是二聚体的DNA结合蛋白，其亚基由转录激活子Rel家族成员组成。Rel家族包括p105p50(NF-B 1)、pl00p50(NF-B2)、p65(Rel A)、C Rel和Rel B五种蛋白以及果蝇的Dorsal和Dif两种蛋白, 其中NFB主要的活性形式是p65与P50或Pp52形成的异源二聚体，发挥NF-B的主要生理功能。NF-B一般与
16、其抑制剂IB 紧密结合，蛋白家族IB在哺乳动物中包括8个成员：IB、IB、IB、IB、IB-R、Bcl- 3、plO0和p105。其中最常见的是IB、IB和IB。由于该家族的共同特征是C末端含有37个锚蛋白重复序列，所以pl00和p105也列入kB家族。IB的锚蛋白重复序列与NF-B的RHD之间通过蛋白质相互作用而结合形成三聚体，从而遮蔽了NTS序列，抑制NF-B的活性并将其滞留在胞质中。多种刺激物质，如IL-1、TNF-和LPS等能引起细胞内的一系列级联反应，激活细胞质内IB激酶，导致IB的磷酸化和泛素化并被26S蛋白酶降解，暴露出NF-B亚基上核定位序列和具有基因转录活性的反式激活域，NF-B从胞浆移位人胞核，发挥基因转录调控的作用。GR-通过与NF-B的p65亚单位相互作用，抑制NF-B的转录活性；反之，NF-B也能对GR-介导的转录进行负性调节。GR-与NF-B之间的相互转录抑制现象涉及多种信号通路和分
