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1、分裂期胚胎慢速程序分裂期胚胎慢速程序 化冷冻胚胎选择研究化冷冻胚胎选择研究 现状现状作者：孟繁玉,蒋彦单位：石家庄市妇产医院生殖医学中心【关键词】 胚胎冷冻技术；辅助助孕技术；妊娠胚胎冷冻技术是开展辅助助孕技术一项必不可少的项目，目的是将在体外受精胚胎移植治疗周期中剩余的胚胎冻存，以后解冻复苏移植，让新鲜周期不成功的妇女增加妊娠机会，这样可以减少对患者卵巢刺激的次数以及多胎的发生和减胎的风险，增加累积成功率。胚胎冷冻常用方法有慢速程序化冷冻和玻璃化冷冻。目前多数行分裂期即受精第 2 天或第 3 天(D2和 D3)胚胎慢速程序化冷冻。也有行原核期(D1)、桑椹期胚胎慢速程序化冷冻1 。Blake
2、 等2认为 D3 卵裂球数目8的胚胎有数个，培养至囊胚期移植 1 个胚胎，其余冷冻，较 D3移植冷冻，妊娠率和抱婴率明显升高。本文就 D2 和 D3 慢速程序化冷冻胚胎做一综述。1 慢速程序化冷冻概况1.1 慢速程序化冷冻保存原理 是使用一定浓度的冷冻保护剂和经程序冷冻仪缓慢降温来实现细胞的逐步脱水。冷冻保存的关键是设法减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤。此时细胞的代谢活动被完全抑制,使细胞的生命在静止状态下保存下来,而得以在超低温环境中永久保存。研究显示液氮深低温保存是保存胚胎的最好的方法3 。1.2 冷冻保护剂的种类及其特点 冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性 2 类。渗透性冷冻保护剂常用有 5
3、 种，其毒性由高到低依次是乙酰胺、丙二醇、二甲亚砜、甘油和乙二醇。该类保护剂一般为低分子化合物，能通过细胞膜并与水结合，也称之为细胞内抗冻保护剂。非渗透性保护剂常用的有蔗糖、聚乙烯吡咯酮、聚乙二醇、白蛋白及葡萄糖等。该类保护剂由于分子量大，不能透过细胞膜，也称之为细胞外抗冻保护剂。2 冷冻胚胎的选择卫生部文件明确规定每周期移植胚胎总数不得超过 3 个，其中35 岁以下妇女第 1 次助孕周期移植胚胎数不得超过 2 个，冻融胚胎的移植周期临床妊娠率10%，但对冷冻胚胎选择的标准没有明确规定。目前通常依据胚胎卵裂球的大小是否均匀、碎片的多少以及卵裂速度判断胚胎形态并分级评分，根据评分选择质量相对较好
4、的胚胎冷冻。2.1 选择优质胚胎冷冻 冻融优质胚胎可以提高冷冻胚胎解冻后的卵裂球存活率或完整率、临床妊娠率4 。Karlstrom 等5研究发现胚胎内碎片20%的胚胎经冷冻后基本无法存活，而只有那些冻存前碎片10%的胚胎，解冻后继续分裂，表明胚胎有发育潜能。优质胚胎判定标准各中心不一，有中心认为 D3卵裂球数目 79 个，均匀或轻度不均，无核碎片20%的胚胎进行冷冻6 。而有的将 D2 卵裂球数目2，D3 卵裂球数目7，卵裂球大小均匀，碎片10%胚胎定义为优质胚胎；将 D2 卵裂球数目2，D3 卵裂球数目4，碎片20%定义为可利用胚胎7 。2.2 选择可用胚胎冷冻 有中心将受精 D2 的 24
5、 细胞或 D3的 68 细胞且碎片20%的胚胎视为可用胚胎，移植后剩余的可用胚胎采用程序化慢速冷冻法冻存8 。有中心选择受精第 2 天碎片30%的 26 细胞或第 3 天碎片30%的 410 细胞进行冷冻9 。而有的中心对新鲜胚胎 D2 移植周期的已分裂的剩余胚胎均给予冷冻；新鲜胚胎 D3 移植的周期冷冻胚胎挑选的原则是卵裂球数目4 个且较 D2 胚胎卵裂球数目有所增加、碎片50%；与 D2 胚胎情况比较卵裂球数目不变或减少，或者胚胎碎片50%的胚胎都不予冷冻10 。2.3 冷冻不同级别胚胎结局比较 解冻复苏 372 个周期，1 493个胚胎，进行回归分析，结果显示冷冻前细胞数6 的胚胎复苏后
6、胚胎存活率高，而且其复苏率和着床率明显高于冷冻前胚胎细胞数少的胚胎(OR=2.44，P0.05)11 。由于卵裂球在冷冻或复苏过程可能受损，优质胚胎耐受冷冻、复苏力强，植入力高，易妊娠12 。有研究显示 D3 冻融胚胎复苏移植的胚胎中至少有 1 个 8 细胞胚胎的妊娠率最高(27.3%，占全部妊娠的 72.2%)，而移植的胚胎均在 4 细胞以下的 32 个周期中仅有 1 例妊娠且在 2 个月时流产。D3 的胚胎如仍处于 4 细胞，提示发育受阻，预后差，此类胚胎是否有冷冻价值值得考虑13 。戴善军等14选择受精第 2 或第 3 天、评分 4 细胞 III 级以上的正常受精胚胎冷冻保存。冻存胚胎根
7、据质量评分分为 3 组：全部为 I 级和(或)II 级的为优质组，III 级的为非优质组，II 级和III 级混合冻存的为混合组。非优质胚胎中有约 92%为 III 级胚胎。研究中发现,3 组的胚胎利用率并没有差别，且冻融非优质胚胎并未引发更多的流产。体外受精患者中，约有 70%的患者获得非优质胚胎。若废弃此类胚胎，则会导致胚胎利用率、累积临床妊娠率的明显降低，不利于治疗结局的改善。各中心根据其实际情况灵活掌握，原则上选择 D3 细胞数4，细胞碎片20%且较 D2 胚胎卵裂球数目有所增加的胚胎冷冻15 。3 分裂期胚胎第 2 天和第 3 天冷冻胚胎比较有研究表明冷冻保存不会影响 D1D3 早期
8、发育阶段胚胎的发育潜能，D2 和 D3 冻融胚胎移植的结果无显著差别8，10，16 。Sifer 等17研究认为 D2 和 D3 冷冻比较，冻融存活率相似，D3 种植率、妊娠率及活婴率均高于 D2。Salumets 等18按冷冻时间分为合子期、D2 和 D3 3 组，结果显示合子期胚胎存活率最高，D2 组为 61.7%，D3 组为 43.1%,差异有显著性，但 3 组的妊娠率、种植率、分娩率、活产率均无差异。而 D3 组流产率(45%)明显增高于 D2 组(18.3%)，认为胚胎冷冻时的发育阶段对胚胎存活率有明显影响，但并不影响妊娠率、种植率、分娩率和活产率。目前国内外研究结果也没有确切的证据
9、表明 D2 冷冻比 D3 冷冻胚胎更有优势19，20 。因此采取在 D2 或 D3 冷冻胚胎均可。对人类胚胎的冷冻技术有待于进一步提高, 尤其是冷冻过程中细胞形态和代谢上的影响。随着现代分子生物学的发展, 人们对于发育生物学和低温生物学的研究将会更加深入，胚胎冷冻技术将会进一步完善。【参考文献】1 Tao J,Craig RH,Johnson M,et al.Cryopreservation of human embryos at the morula stage and outcomes after transferJ.Fertil Steril.2004,82(1):108118.2 Bl
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