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1、第 2 章DNA重组克隆的单元操作,DNA重组的载体； DNA的体外重组； 重组DNA分子的转化与扩增； 转化子的筛选与重组子的鉴定； 目的基因的克隆。,2.1 用于基因克隆的载体,质粒（plasmid）,噬菌体,考斯质粒（cosmid）与噬菌粒,人造染色体载体,载体的功能及特征,载体的功能及特征,1.载体的功能, 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力, 为外源基因提供复制能力或整合能力, 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,2.载体应具备的条件, 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。, 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。, 具有合适的筛选标记。, 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合
2、位点。,质粒,1.质粒的基本特征,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。,质粒常见于原核细菌和真菌中。,绝大多数的质粒是DNA型的。,绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构。,质粒DNA的分子量范围：1 - 100 kb。,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,控制复制引物与模板的结合,ori,E.coli ColE1 plasmid,复制方向,rop,（+）,Rop,RNA II,RNA I,3,5,5,3,质粒,质粒的基本特征,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,控制复制起始因子与复制
3、起始位点（ori）的结合,Pcop,cop,P/Orep,rep,ori,Cop,Rep,可扩增性,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为,两大复制类型：,严紧型复制控制的质粒 1 - 5 拷贝 stringent plasmid,松弛型复制控制的质粒 30 - 50 拷贝 Relaxed plasmid,质粒的可转移性,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：, 接合型质粒： 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一,个细胞（接合作用）。, 非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。,质粒的不相容性,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时,存在于一个细胞中，这种现象称为质
4、粒的不相容性。,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,pSC101、F拥有相似的复制子结构，彼此不相容,携带特殊的遗传标记,物质抗性：抗生素、重金属离子、紫外线、X射线,物质合成：细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。,2.质粒的改造与构建,野生型质粒分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多由pSC101、ColE1和pSF2124构建。, 删除非必需区域DNA。 灭活某些质粒的编码基因。如mob基因，负调控基因 加入标记基因。 添加MCS，删除重复酶切位点。 加上一些调控序列。,
5、3.质粒的分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：,高拷贝质粒 扩增基因,低拷贝质粒 表达某些毒性基因,测序质粒 用于测序,整合质粒 外源基因的整合,穿梭质粒 基因克隆,表达质粒 表达外源基因,探针质粒 启动子等元件的克隆筛选,4.重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50 - 100 / cell,用于基因克隆,pUC18 / 19：,拷贝数 2000 - 3000 / cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,
6、MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,蓝色,pGEM-3Z：,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,用于外源基因的高效表达,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3Z,PSP6,酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶。如,E.coli BL21（DE3）等。,碱溶法,i.用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,ii.加溶菌酶裂解细菌细胞壁,iii.加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内
7、含物,iv.加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染,色体DNA及大部分蛋白质,v.离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质,vi.乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA,vii.用无DNase的RNase去除残余的RNA,cccDNA,L-DNA,ocDNA,5.质粒DNA的分离纯化, 沸水浴法,i.用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体,ii.加溶菌酶裂解细菌细胞壁,iii.沸水浴40秒钟,iv.离心，用无菌牙签挑去沉淀物,v.乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA,噬菌体,噬菌体是一类特异性的病毒，能高效率高特异性地侵染,宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜,伏起来
8、，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,1. 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体的生物学特性,l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48.5kb,全基因组共36个基因, 生物结构,5 GGGCGGCGACCT,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l - DNA, 感染裂解周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,体内包装,100个左右的拷贝,包装
9、范围为原DNA的75 - 105%,即 36 - 51 kb,D,A, 溶原状态,l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态。,l-DNA载体的构建,野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。 根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体, 缩短长度,插入型载体,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度 37 kb,插入片段大
10、小：,0 - 14 kb,（51 37）,取代型载体,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,（51 26）,载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,（36 26）, 删除重复的酶切位点,野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，,不利于重组操作，必须删除至1 - 2个。,同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增,加一些单一的酶切位点。,灭活某些与裂解周期有关的基因，构建琥珀密码子的突变体,琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专
11、一性地纠正这一突变。 基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。,加装选择标记,野生型l-DNA上缺少合适的选择标记。,l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,加装选择标记：cl+,含有完整标记基,因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状,态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源,DNA插入到标记基因中，基因灭活， l-重,组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。,加装选择标记：lacZ,lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化,无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因,插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成,蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生
12、蓝色,透明斑。,以EcoR为例,A、B、C、D、E和F片段长度分别为21.6kb、4.9kb、5.5kb、7.5kb、5.9kb和3.3kb,用于建立cDNA文库和克隆外源目的基因,2.6kb,非必需区引入筛选标记,l-DNA重组分子的体外包装,l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。,l-DNA及其重组分子的分离纯化, 将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期；, 加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时；, 用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬
13、菌体颗粒,密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解；, 超速离心，沉淀噬菌体；, 苯酚抽提，释放l-DNA ；, 乙醇或异丙醇沉淀l-DNA 。,l-DNA作为载体的优点, l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒。, l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量。, 重组l-DNA分子的筛选较为方便。, 重组l-DNA分子的提取较为简便。,2.大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,M13噬菌体的生物学特性,M13噬菌体的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,M13 DNA全长6407个核苷酸,M13 DNA上有10个基因,2700个外壳蛋白分子,M
14、13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长, 生物结构, 感染周期,E.coli,基因II蛋白,基因II蛋白,基因V蛋白,M13 DNA载体的构建,III VI I IV II X V VII IX VIII,野生型M13RF-DNA,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13mp系列载体,lacZ,polylinker, 通过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口；, 引入合适的选择性标记基因；, 在MCS接头片段的两侧区域改为统一的DNA测序引物。, 加入MCS；,考斯质粒与噬菌粒,考斯质粒和噬菌粒载体的构建是为了提高噬菌体DNA的装载量。,将噬菌体DNA中与包装有
15、关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。,1.考斯质粒（cosmid）,考斯质粒载体的构建,考斯质粒是一类人工构建的含有,pHC79,6100 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,l-DNA cos序列和质粒复制子的,特殊类型的载体。,1.7 kb的l-DNA片段 + pBR322片段,装载范围为31 - 45 kb。,考斯质粒载体的特点, 能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞。, 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围。,
