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1、 病理科论文病理学论文病理技术论文：去瓣型去瓣型 Epi-LASIK 和和 PRK 对兔角膜病理影响的对比研究对兔角膜病理影响的对比研究【摘 要】 目的 对比研究去瓣型准分子激光上皮下角膜磨镶术(epi-polis laser in-situ keratomileusis, Epi-LASIK)和准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractive keratectomy, PRK)对兔角膜病理的影响。方法 新西兰白兔 34 只,随机取其中 32 只兔的右眼行去瓣型 Epi-LASIK(A 组),左眼行PRK(B 组),另外 2 只兔(4 只未手术眼)为正常对照组(C 组)。术后 4 h
2、、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、1 个月、3 个月取角膜标本,HE 染色观察角膜前基质细胞的数量变化,免疫细胞化学染色观察角膜中央区 Ki-67、-SMA 阳性细胞数量及角膜切削缘区 PCNA 阳性细胞数量,同时透射电镜观察角膜超微结构的变化。结果 正常角膜前基质细胞数量为每 400倍光镜(88. 005. 38)个;术后各时间点 B 组前基质细胞数量均较 A 组少,差异均有显著统计学意义(均为 P0. 05);术后各时间点 B 组 PCNA 阳性细胞数量均较 C 组多,差异均有统计学意义(均为 P0. 05)。术后 1 d、3 d、5 d、7 d、14 dA 组 PCNA 阳性细
3、胞数量均较 B 组少,差异均有统计学意义(均为 P005 或 0. 01)。2. 3 K i-67 阳性细胞数量 正常角膜(C 组)基质层几乎不表达 Ki-67,Ki-67 阳性细胞数量为 0。术后各时间点A、B 组平均 Ki-67 阳性细胞数量见表 3。术后 4 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 dA、B 组 Ki-67 阳性细胞数均较 C 组多,差异均有统计学意义(均为 P005)。术后 4 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d A 组 Ki-67 阳性细胞数均较 B 组少,差异均有显著统计学意义(均为 P0. 01)。2. 4 -SMA 阳性细胞数量 正常角膜(C 组)几
4、乎不表达 -SMA,-SMA 阳性细胞数量为 0。术后各时间点A、B 组平均 -SMA 阳性细胞数量见表 4。术后 5 d、7 d、14 d、1 个月、3 个月 A、B 组 -SMA 阳性细胞数量均较 C 组多,差异均有统计学意义(均为 P005)。术后 5 d、7 d、14 d、1 个月、3 个月 A 组 -SMA 阳性细胞数均较 B组少,差异均有显著统计学意义(均为 P0. 01)。2. 5 透射电镜观察2.5. 1 C 组 角膜上皮为 35 层未角化的复层扁平上皮,表面为 12 层扁平细胞,其下是 12 层翼状细胞,基底为 1层柱状细胞,各层细胞排列规则(图 1)。基底细胞可见较多的半桥
5、粒,基底膜连续,前弹力层菲薄,不连续。基质层胶原纤维排列整齐,成纤维细胞呈长椭圆型,可见少量线粒体、粗面内质网(图 2)。2. 5. 2 B 组 术后 4 h,大量角膜前基质细胞皱缩变圆,核形不规则,染色质固缩聚于核膜周边,线粒体基本正常,粗面内质网膨大,胞膜完整,可见出泡现象和凋亡小体形成,呈典型细胞凋亡特征(图 3);术后 1d,角膜上皮细胞 1 层覆盖切削区,基底细胞呈斜柱状、扁平状,成纤维细胞体积未见增大,胶原纤维排列轻微紊乱(图 4);术后 3 d,角膜上皮细胞 1 层或 2 层覆盖切削区,角膜前基质胶原纤维排列紊乱,深层基质胶原纤维排列较整齐;术后 5 d,角膜上皮细胞 3 层或
6、4 层覆盖切削区;术后 7 d,角膜上皮细胞 4 层或 5 层覆盖切削区,上皮基底膜与基质交界处略显疏松,胶原纤维排列紊乱;术后 14 d,上皮基底细胞的半桥粒稀疏,基底膜薄且不连续;术后 1 个月,角膜上皮细胞增至 68 层,上皮细胞体积增大,细胞内游离核糖体增多,成纤维细胞体积增大,胶原纤维排列异常紊乱;术后 3 个月,角膜上皮细胞基本恢复正常,基底膜不连续、不规则,半桥粒数目较少,成纤维细胞体积肥大,内质网池显著扩张,线粒体数量增加,胶原纤维排列较前整齐。2. 5. 3 A 组 术后 4 h7 d 基本和 B 组相同,但细胞之间结合更紧密(图 5-图 7);术后 1 个月,上皮细胞形态基
7、本正常,其胞核体积增大,半桥粒数目未减少,基质内胶原纤维排列轻微紊乱,成纤维细胞体积显著增大,细胞内线粒体数量增加,内质网池扩张;术后 3 个月,成纤维细胞形态及细胞器基本恢复正常,胶原纤维排列较整齐(图 8)。3 讨论Ghanem 等4报道 PRK 术后 1 个月时 haze 的发生率为86%,术后 3 个月时仍高达 84%。Mohan 等5甚至报道用兔角膜行 PRK 术后 1 个月时 haze 的发生率为 100%。Long 等6报道 Epi-LASIK 术后 1 个月时 haze 的发生率为 40%,术后 3 个月时降为 10%。Pallikaris 等7报道 Epi-LASIK 术后3
8、 个月时 haze 的发生率为 3%。PRK 和 Epi-LASIK 术后haze 发生率的差异如此之大,我们可以从 haze 形成的几个重要影响因素进行分析。3. 1 角膜基质细胞凋亡 角膜基质细胞的凋亡诱发胶原沉积和胶原解体,是角膜损伤后 haze 形成的始动因素。角膜基质细胞的凋亡主要局限于前基质层 5070m 的区域8-9。因此,我们在 400 倍光镜下对 PRK 和去瓣型 Epi-LASIK 术后各个时间点的角膜中央区前基质细胞计数,并与正常角膜做对照来判断 2 种手术术后角膜基质细胞凋亡的差异。前基质细胞数量越少,说明角膜基质细胞凋亡越多,对haze 的形成越有利。本研究结果表明,
9、 PRK 和去瓣型 Epi-LASIK 术后前基质细胞数量均有明显的减少,各时间点 PRK组前基质细胞数量均较去瓣型 Epi-LASIK 组少,差异均有显著统计学意义(均为 P001)。造成上述差异的一个可能重要原因是,角膜损伤后白细胞介素-1 和转化生长因子- 等信号分子在肌成纤维细胞转化和伤口收缩等方面起重要作用,而 PRK 术后角膜上皮细胞基底膜不完整,减弱了来自角膜上皮或泪液中的信号分子如白细胞介素-1 和转化生长因子-等对角膜刺激的屏障作用8, 10。3. 2 角膜上皮细胞增殖 角膜屈光术后细胞增殖是角膜伤口愈合的必要条件,其主要包括上皮细胞和角膜基质细胞的增殖。通过各种细胞因子和生
10、长因子的高水平释放,刺激细胞增殖和抑制角膜上皮细胞的分化,可能会促进 haze 的形成和屈光回退9, 11。PC-NA 是一种不含组蛋白的核蛋白,其作为 DNA 聚合酶 的辅助因子,在细胞周期 G1 期合成, S期达高峰, S 期早期分布于细胞浆内(细胞核缺乏), S 期晚期主要存在于细胞核内,与细胞循环有关,一般在细胞增殖期表达,也称细胞周期蛋白,所以 PCNA 被作为表达细胞增殖活性的标志11。我们的研究发现,术后 1d、3 d、5 d、7 d、14 d,PRK 组 PCNA 阳性细胞数量均较去瓣型 Epi-LASIK 组多,差异均有统计学意义(均为 P0. 05),说明 PRK 的细胞增
11、殖更多,更易造成 haze。3. 3 角膜基质细胞增殖 角膜上皮损伤后数小时,角膜基质细胞开始出现增殖和移行,这进一步促成了肌成纤维细胞的分化和移行,而增殖蛋白 Ki-67 是细胞 G1-M 期的标志蛋白,可以标记角膜基质细胞的增殖情况11-13,因此不管是反映角膜上皮的损伤程度还是向肌成纤维细胞转化的潜力,Ki-67 阳性细胞数量都是预测 haze 的一个重要指标。我们的研究发现,术后 4 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d,Epi-LASIK、PRK 组 Ki-67 阳性细胞数量均较正常组多,差异均有统计学意义(均为 P0. 05); PRK 组 Ki-67 阳性细胞数量均较去瓣
12、型 Epi-LASIK 组多,差异均有显著统计学意义(均为P0. 01),这说明 PRK 具有比去瓣型 Epi-LASIK 更重的角膜上皮损伤反应和更高的 haze 发生可能性。3. 4 肌成纤维母细胞增殖 基质层表面不规则导致的角膜上皮基底膜的结构性和功能性损伤使得角膜基质细胞向肌成纤维母细胞演变,进而向肌成纤维细胞转化,而肌成纤维细胞是 haze 形成的主要细胞因素,-SMA 则是肌成纤维细胞细胞骨架的标志蛋白14-16。因此,-SMA 也是反映haze 发生可能性的重要指标。从我们的研究来看,术后 5 d、7 d、14 d、1 个月、3 个月去瓣型 Epi-LASIK、PRK 组-SMA
13、 阳性细胞数量均较空白对照组多,差异均有统计学意义(均为 P0. 05); PRK 组 -SMA 阳性细胞数量均较去瓣型 Epi-LASIK 组多,差异均有显著统计学意义(均为 P0. 01)。这充分证实了 PRK 比去瓣型 Epi-LASIK 术后向肌成纤维细胞的转化更活跃,从而造成 haze 的发生可能性更高。3. 5 角膜超微结构改变 从透射电镜的结果来看,PRK和去瓣型 Epi-LASIK 术后 7 d 之内,去瓣型 Epi-LASIK 组细胞之间结合更紧密, 1 个月、3 个月时基质内胶原纤维排列更整齐,而大量排列混乱的胶原纤维正是角膜 haze 形成的一个重要的直接原因8,因此这也
14、直接证明去瓣型 Epi-LASIK术后 haze 的程度更轻。总之,本研究结果显示出去瓣型 Epi-LASIK 比 PRK 有着更轻的角膜上皮损伤反应,更少的角膜上皮细胞和角膜基质细胞的增殖、分化、移行以及更低的向肌成纤维母细胞转化的潜能,从而 haze 的发生可能性更低。参考文献1 Marshall J, Trokel SL, Rothery S, Krueger RR. Long-term healingof the central cornea after photorefractive keratectomy using anexcimer laserJ.Ophthaml ology,
15、1988,95(10):1411-1421.2 CamellinM,WylerD. Epi-LASIK versus Epi-LASEKJ.J RefractSurg,2008,24(1): S57-63.3 Pallikaris IG, Katsanevaki VJ, Kalyvianaki M I, Naoum idi II. Ad-vances in subepithelialexcimer refractive surgery techniques: Epi-LASIKJ.Curr Opin Ophthaml ol,2003,14(4):207-212.4 Ghanem VC,Kara
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