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1、离体蛙心灌流【目的要求】l1、学习斯氏离体蛙心灌流法。l2、观察离子及药物等对离体心脏活 动的影响。【基本原理】l心脏的正常节律性活动需要一个适宜的内 环境（如Na，K，Ca2等的浓度及比例 、pH值和温度），内环境的变化直接影响 到心脏的正常节律性活动。l将失去神经支配的离体心脏保持于适宜的 理化环境中（任氏液Ringer solution）， 在一定时间内仍能产生自动节律性兴奋和 收缩。离子对心脏活动的影响l改变任氏液的组成成分，离体心脏的活动 就会受到影响。lK+参与心肌细胞的复极化和自律细胞的4期 自动去极化过程，其改变不仅取决于细胞 内外K+浓度梯度，还与细胞膜对K+通透性有 关，因
2、此其影响是多方面的。lCa2+对Na+内流存在竞争抑制作用，称膜屏 障作用，对静息电位无影响。Ca2+o ， 可使心肌细胞的兴奋性降低，传导减慢， 收缩力增强。l在体心脏受交感神经和迷走神经的双重支 配 交感神经末梢释放去甲肾上腺素，与心肌细胞 受体结合，使心肌收缩力加强，传导速度加 快，心率加快；阻断剂心得安 迷走神经末梢释放乙酰胆碱，与心肌细胞M受 体结合，使心肌收缩力减弱，心肌传导速度减 慢，心率减慢；阻断剂阿托品【动物、器材与试剂】l蟾蜍或蛙、纱布、毁髓针、眼科镊、手 术剪、眼科剪、蛙板、蛙钉、玻璃分针 、滴管、细棉线、蛙心夹、铁支架、万 能滑轮、小烧杯、斯氏蛙心套管、双凹 夹、套管夹
3、、张力换能器、生物信号计 算机采集系统l任氏液、0.65% NaCl 、2% CaCl2 、1% KCl 、1/10000肾上腺素、1/10000乙酰 胆碱、阿托品、300U/ml肝素。【方法与步骤】l1、仪器准备l2、离体蛙心的制备l3、连接实验装置l4、实验观察1、仪器准备l打开计算机生物信号采集系统，选择 实验项目-循环实验-离体蛙心灌流。l熟悉实验标记的使用。l参考：生理模拟实验软件-离子和药物 对离体蛙心的影响2、离体蛙心的制备（斯氏蛙心插管法）l在左主动脉下方穿 线，靠上端结扎， 作插管时牵引用l在主动脉干下方穿 线，在动脉圆锥上 方打一活结备用（ 用以结扎和固定插 管）。取蛙或蟾
4、蜍，取蛙或蟾蜍，双毁髓双毁髓后后背位背位置于蛙板上，暴置于蛙板上，暴 露心脏。仔细识别心脏周围的大血管。露心脏。仔细识别心脏周围的大血管。l左手提起左主动脉上方的结扎线，右手用眼 科剪在结扎线下方、沿向心方向将动脉管壁 剪一斜口（注意要剪破血管内膜，每次心缩 时有血自切口涌出，但不要把血管剪断，剪 口位置视套管尖端长度与心脏大小而定）。l选择大小适宜的斯氏蛙心套管，盛入少量任 氏液（内加一滴肝素溶液，套管内23cm 高度） 。l左手用眼科镊提起切口缘，右手将注有任氏 液的斯氏套管插入动脉干内，然后左手持左 侧血管分支上的结扎线向外拉，右手将蛙心 套管送入动脉圆锥。l当套管尖端到达动脉圆 锥基部
5、时，应将套管稍 向后退（因主动脉内有 螺旋瓣会阻碍插管前进 ），并将套管尾端稍向 右主动脉方向及腹侧面 倾斜，使插管尖端向动 脉圆锥的背部后下方及 心尖方向推进，在心室 收缩时经主动脉瓣进入 心室。l注意插管不可插得过深，插管的斜面应 朝向心室腔，以免插管下口被心室壁堵 住。此时可见血液冲入套管，并使液面 随心脏搏动而上下移动，表明操作成功 （否则需退回并重新插入）l用滴管吸去套管中的血液，换新鲜任氏 液。l稳定住套管后，轻轻提起备用线，将左、 右主动脉连同插入的套管用双结扎紧（不 得翻液），再将结线固定在套管的小玻璃 钩上，然后剪断结扎线上方的血管。l看清静脉窦的位置，在心脏的下方绕一线 ，
6、将左右肺静脉及前后腔静脉一起结扎（ 注意切勿损坏静脉窦）。轻轻提起套管和 心脏，于静脉窦下方剪断有牵连的组织， 仅保留静脉窦与心脏的联系，使心脏离体 。l用任氏液反复冲洗心室内余血，使套管内 灌流液不再有残留血液。保持套管内液面 高度一致（1.52cm，或在套管的下1/3处 结一线作为标志，每次换任氏液时使液面 与此线相平），即可进行实验。其他方法技巧l用蛙心夹提起心尖，使心室与动脉圆锥约 呈100-200的钝角，然后当心室缩紧时把 套管平直往心室方向推进。当感觉套管进 入心室后再把心尖放平，随即将套管稍向 心室推进，调整合适位置，可见套管内液 面随心跳而升降。3、连接实验装置l将套管固定在支
7、架上 ，用蛙心夹在心舒期 夹住少许心尖部肌肉 （不要夹多，以免夹 破心室而漏液）。l将蛙心夹上的系线绕 过一个滑轮与张力传 感器相连。勿使灌流 液滴到传感器上。调节记录仪器上的收缩曲线的幅度适中。调节记录仪器上的收缩曲线的幅度适中。4、实验观察l1)记录正常心搏曲线。l2)改用0.65% NaCl溶液灌流，并作好加 药标记，观察心搏变化。待曲线出现明显 变化时，立即吸去套管中的灌流液，同时 做好冲洗标记，并用新鲜任氏液清洗2 3次，待心搏恢复正常。l注意：换液时切勿碰套管，以免影响描记 曲线的基线，同时保持灌流液面一致（下 同）。l3)向套管内加26滴5% NaCl溶液，作好 加药标记，观察心
8、搏曲线的频率及振幅变 化。当曲线出现明显变化时，应立即吸去 套管中的灌流液，并做好冲洗标记，迅速 用新鲜任氏液清洗23次，待心搏恢复正 常。 l4)向套管内加12滴2% CaCl2溶液，作好 加药记号，观察心搏曲线的频率及振幅变 化。标记、冲洗至心搏恢复正常 l5) 向套管内加入12滴1% KCl溶液，记录 心搏曲线的变化。当心搏曲线变化时，同 法更换灌流液，待心搏恢复正常。l6)同法记录套管中加入12滴肾上腺素溶 液(1/10000)后心搏曲线的变化。l7)同法记录套管中加入12滴乙酰胆碱溶 液(1/10000)后心搏曲线的变化。l8)同法记录套管中先加入阿托品后再加1 2滴乙酰胆碱溶液(1
9、/10000)后心搏曲线的变 化。【注意事项】l1、制备离体心脏标本时，勿伤及静脉窦。l2、蛙心夹应在心室舒张期一次性夹住心尖，避 免因夹伤心脏而导致漏液。l3、每一观察项目都应先描记一段正常曲线，然 后再加药并记录其效应。加药时应在心跳曲线 上予以标记，以便观察分析。l4、各种滴管应分开，不可混用。l5、在实验过程中，插管内灌流液面高度应保持 恒定；仪器的各种参数一经调好，应不再变动 。l6、标本制备好后，若心脏功能状态不好（不搏动 ），可向插管内滴加12滴2%CaCl2或1：10000 肾上腺素，以促进（起动）心脏搏动。在实验程 序安排上也可考虑促进和抑制心脏搏动的药物交 换使用。l7、给
10、药后若效果不明显，可再适量滴加，并密切 注意药物剂量添加后的实验结果。给药量必须适 度，加药出现变化后，就应立即更换任氏液，否 则会造成不可挽回的后果，尤其是K稍有过量， 即可导致难以恢复的心脏停跳。 l8、谨防灌流液沿丝线流入张力传感器内而损坏其 电子元件。实验结果实验项目收缩强度心率 处理前处理后处理前处理后0.65% NaCl 2% CaCl2 1% KCl 1：10000 E 1：10000 Ach 阿托品+AchCaCl2灌流Ca2+ o Ca2+内流Ca2+i兴奋-收缩耦联收缩力KCl灌流K+ oAP平台期缩短Ca2+内流兴奋-收缩耦联收缩力1:10000 E灌流4期 If 、I
11、CaT通道4期自动去极速度自律性心率与心肌1受体结合Ca2+内流 肌浆网释放Ca2+兴奋-收缩耦联收缩力cAMP1:10000 Ach灌流与心肌M受体结合K+外流, Ca2+内流E-C耦联收缩力最大复极电位4期K+外流自律性心率Ca2+i【思考题】l1、心脏灌流说明心肌的哪些生理特性？l2、用实验说明内环境相对恒定的重要意义 。l3、试分析任氏液中适量的钠离子、钙离子 与钾离子对心肌的作用。l4、为何强调实验中保持灌流液面的恒定? 灌流量对心脏活动会有什么影响？l5、试想，活的机体在心交感神经兴奋或心 迷走神经兴奋时对心脏会有什么影响？实验拓展l温度的影响：把套管内换成4任氏液，同时作好标记，观察曲线变化，待效应明显后，即 换入室温任氏液。待曲线恢复正常后，再进行 下一项目。同法，换入40的任氏液，如上观 察。或以冰块、40热水接触静脉窦，效果更明显。l酸碱等药物的影响：加2.5%NaHCO31滴，混 匀；加3%乳酸1滴，待效应明显后，再加1滴 2.5%NaHCO3，观察曲线的变化。
