Western+实验操作程序

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1、Western blot 实验操作程序实验操作程序 一、储存液的配制：一、储存液的配制： 1. )1.5M Tris-HCl（PH8.8）：）：100ml Tris 18.15g 去离子水 50 ml 缓慢加浓盐酸调 PH 至 8.8（约 4 ml） ，冷却至室温后再加去离子水至 100 ml. 2.) 0.5M Tris-HCl（PH6.8）：）：100ml Tris 6.05g 去离子水 50 ml 缓慢加浓盐酸调 PH 至 6.8（约 8ml） ，冷却至室温后再加去离子水至 100 ml. 3. )10%SDS（W/V）：）：100ml SDS 10g 去离子水 100 ml 溶解后，室

2、温下保存。 4.)50%（v/v）甘油：）甘油：100ml 100%甘油 50 ml 去离子水 50 ml 混匀后，室温下保存。 5. )1%溴酚蓝：溴酚蓝：10 ml 溴酚蓝 100mg 去离子水 10ml 搅拌至完全溶解，经过滤后使用 6. )丽春红丽春红 S(Ponceau S)储存液：储存液：100 ml 丽春红 S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 去离子水 100ml 混匀后，室温下保存。7. )10转膜液：转膜液：1000 ml 甘氨酸 90g Tris 19.3g 加去离子水至 1000 ml，PH 在 8.3-8.4 左右. 二、工作液的配制：二、工作液的配制： 1

3、. 组织（或细胞）裂解液：组织（或细胞）裂解液：3 ml 或或 5 ml 试剂初始浓度终浓度3 ml5 mlNaCl 1 mol/L0.1 mol/L300l500l Tris-HCl1mol/L0.01mol/L 30l50l EDTA0.5mol/L0.001mol/L 6l 10l Aprotinin1mg/ml 0.001mg/ml3l 5l PMSF 10mg/ml0.01mg/ml30l50l TritonX-100 3%1%1 ml1.6ml去离子水1.64ml2.8mlPMSF（苯甲基磺酰氟）：可抑制蛋白酶的降解作用，有较强的毒性，可严重损 害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，使用时需戴

4、手套操作。它在水溶液中不稳定，使用时需新鲜配制（可先配成 10 mg/ml 的储存液，需用异丙醇溶解） 。 Aprotinin（抑肽酶）：可抑制组织裂解后释放出的蛋白酶对蛋白质的降解作用。 2.2. 55变性变性 loading:10 ml1M Tris-HCl（PH6.8）0.6 ml60mM50%甘油5ml25%10%SDS2ml2%1%溴酚蓝1 ml0.1%去离子水0.9ml混匀，在 4oC 下可保存数月。3. 丙烯酰胺储存液（丙烯酰胺储存液（30%）：）：100 ml 丙烯酰胺 29 g 双丙烯酰胺 1g去离子水 100 ml丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体均具有强神经毒性，其作用具有累加性，

5、配制时必须戴 手套，防止皮肤接触。 搅拌至完全溶解，在 4oC 下可保存数月。 4. 4 分离胶缓冲液：分离胶缓冲液：100 ml 2M Tris-HCl（PH6.8） 75 ml 1.5M 10%SDS 4ml 0.4% 去离子水 21ml 混匀后可在 4oC 下保存数月，配分离胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用 4的 缓冲液即可 5. 4 堆积胶缓冲液堆积胶缓冲液: 100 ml 1M Tris-HCl（PH6.8） 50 ml 0.5M 10%SDS 4ml 0.4% 去离子水 46ml 混匀后可在 40C 保存数月，配堆积胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用 4的缓 冲液即可 6.

6、10%过硫酸胺过硫酸胺(APS)：5 ml 过硫酸胺 0.5g 去离子水 5ml 分装后，保存于-200C 7. 电泳缓冲液电泳缓冲液:1000 ml Tris 3g 25 mM 甘氨酸 14.4g 192 mM SDS 1g 0.1% 加去离子水至 1000 ml，PH 在 8.3 左右。 8. 考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝染色液: 1000 ml 考马斯亮蓝 R-250 1.0g 甲醇 450 ml 冰醋酸 100 ml 去离子水 450 ml 需过滤后使用，可用来染蛋白质.9. 考马斯亮蓝凝胶脱色液考马斯亮蓝凝胶脱色液: 1000 ml 甲醇 100 ml 冰醋酸 100 ml 去离子水

7、800 ml 可使染色的凝胶脱色,以减低背景。 10. 丽春红丽春红 S 工作液：工作液： 100 ml 丽春红 S 储存液 10 ml 去离子水 90 ml 可用来染蛋白质. 11. 1 转移缓冲液：转移缓冲液： 1000 ml10转移缓冲液 100 ml 甲醇 200 ml 去离子水 700ml 可回收利用 三、操作步骤：三、操作步骤： 1. 组织（或细胞）的裂解：组织（或细胞）的裂解： 取所需的组织，如：脑、脊髓或其他组织，操作时动作要快且最好在冰上进行。将其 转移到已清洗干净并烘干后的匀浆器中，加裂解液进行匀浆（裂解液的量根据组织块 的大小确定） ，匀浆时需将匀浆器置于碎冰块中，且匀浆

8、时间不能太长（约 3-5 分钟， 或匀浆器抽拉 30-40 次） ，抽拉时动作要慢，以减少气泡的产生。 若要裂解细胞，所加的裂解液量不能太多，以免蛋白质浓度太低，不易检测。 若取培养基收集蛋白质，则不须裂解 2. 离心：离心： 先启动离心机预冷，将温度降至 4，将裂解后的溶液转移至小管中， （根据溶液的 量选取大小合适的小管） ，速度要快，以免蛋白质降解，将小管平衡好之后，放入离 心机中离心，转速 30005000 转/分为宜，离心时间 15 分钟左右。 3. 蛋白质的变性处理：蛋白质的变性处理： 将离心后的小管取出，吸取上清，转移至另一小管中，吸取时要小心，不要将沉淀吸 出，向小管中按 4：

9、1 的比例加变性 loading ，将盖子盖好，用胶带缠紧，将小管插入 到一塑料泡沫上，以防止小管沉底，放入沸水中变性，注意：小管中的液体不能太 多，以免加热后管子爆开，可将盖子用胶带缠紧，须等水沸腾后将小管放入，不然 会影响变性效果，变性时间为 510 分钟离心后立即变性，防止蛋白质的进一步降 解。 变性后的样品置于 4oC，可多次使用。 4.灌胶前的准备：灌胶前的准备： 用前须将灌胶用的玻璃板洗干净，烘干，操作时避免用手接触灌胶面，将两侧的隔条 上涂抹一层薄薄的凡士林，不要涂得太宽，以免凡士林进入灌胶面，小心将两块玻璃 板叠在一起，插入到橡胶框中，将长玻璃板向外倾斜放置，在其底部加 10%

10、的琼脂糖 凝胶封底（用前将琼脂糖在微波炉中加热至融化，加热时间不能太长，以免沸腾太厉 害，污染微波炉） ，加琼脂糖的目的是防止液体渗漏，待琼脂糖凝固后，将玻璃板及 橡胶框轻轻置于电泳槽中，旋紧螺栓，也可再加琼脂糖封边封底，在两玻璃板之间加 双蒸水，观察有无液体渗露，若有则需重新封底。 5. 灌注分离胶：灌注分离胶：（根据我室的灌胶设备，配 10ml 即可） 灌胶前需根据要检测的组织及蛋白质种类的不同，选用不同浓度的凝胶，常用浓度为 10% 丙烯酰胺溶液（30.8%）3.4ml4分离胶缓冲液（PH8.8）2.5 ml去离子水4.1 ml10%过硫酸胺(APS)30ulTEMED5-8ul其中过硫

11、酸胺提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基，而 TEMED 通 过催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合。 灌胶之前在电泳槽上确定要灌的分离胶的最上液面到达的位置，即将梳子插入到两 玻璃板之间，梳子下端下方 1cm 左右处即为分离胶的最上液面，将上述液体充分混 匀后，快速加入到两玻璃板之间，加液体时可沿一侧壁加入，以免产生气泡，待分 离胶加至所需液面水平时，停止加分离胶，向其中加去离子水，其作用一方面防止 分离胶氧化，另一方面可将分离胶的液面压平。APS 和 TEMED 的量不能太多，以 免凝固太快，形成的凝胶不均匀，以 30-45 分钟凝固为宜。 6. 灌堆积胶：灌堆

12、积胶：4ml 待分离胶完全凝固后，将水倒出，再向其中加堆积胶，其配方为：丙烯酰胺溶液（30.8%） 0.67ml4堆积胶缓冲液(PH6.8) 1 ml去离子水 2.3ml10%过硫酸胺(APS) 15ulTEMED 5ul堆积胶的作用为使分散的样品在进入分离胶之前聚集成一条细线，使起跑位置基本 一致，待堆积胶灌至离最上方 0.5cm 时，插入梳子，再将液体加满，因堆积胶凝固 后会有小部分回缩，需在其上方多加一些，以免形成的加样孔不够长，影响上样量， 堆积胶凝固后，将梳子轻轻拔出，拔出时两侧用力要均匀，以免损伤加样孔，若两 加样孔之间的凝胶条有倾斜，需将其轻轻扶直，最好将设备置于 4oC 过夜备

13、用，因 过夜后凝胶的聚合会更好一些，有利于跑胶。 7. 电泳：电泳： 将电泳槽中加入电泳缓冲液，电泳缓冲液的液面须高于凝胶的最上端，且注意电极 的方向（长玻璃板侧对红面，电泳仪的电极与电泳槽的电极相互对应即可） ，将电源 打开，观察电流的大小，若电泳缓冲液反复使用次数太多，电流太小，则需更换电 泳缓冲液。之后将电源关闭，向加样孔中加入已变性的样品，根据蛋白质的浓度确 定上样量，或预先将样品按不同的上样量加入到加样孔中，根据电泳后的条带确定 上样量，若是细胞样品，或蛋白质的浓度太低，则需将样品浓缩。 在胶的一侧加一 marker，marker 的用量约 2-5ul，以确定蛋白质条带的分子量的大小

14、， marker 与样品之间最好隔一加样孔，以利于切割，电泳时，以小电流为好，我室的 经验是电压调至 100V，电流约 5mA 左右，同时需将电泳槽放入冷水中，因电泳时 有热产生，会影响跑胶，导致中间的样品速度较快而两边的样品速度较慢，跑出的 条带不在一条直线上，待溴酚蓝指示剂完全进入琼脂糖凝胶中，停止电泳。 8. 考马斯亮蓝染色及脱色考马斯亮蓝染色及脱色： 将两玻璃板轻轻分开，使凝胶在一块玻璃板上，去掉分离胶两侧的琼脂糖及堆积胶， 将凝胶小心从玻璃板上取下，置于考马斯亮蓝染色液中，过夜，次日将考马斯亮蓝 染色液回收，将染色后的凝胶放入内有考马斯亮蓝脱色液的平皿中脱色，可在脱色摇床上摇动以加快脱色，中间换两次脱色液，待背景基本无色时即可，脱色时间不 能太长，以免蛋白质条带颜色过浅， 将凝胶取出，用保鲜膜包好，置于 4oC 冰箱中保存或照相。 9. 转膜转膜 将海绵、滤纸和硝酸纤维素膜在转膜液中浸湿备用。摊开转膜夹，先根据需要转膜 的凝胶