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1、1不同海拔高原地区严重烫伤延迟复苏大鼠肺组织细胞凋亡及基因调控机制【摘要 】 目的：探讨不同海拔的高原地区严重烫伤延迟复苏后肺组织细胞凋亡及其基因调控机制. 方法: 雄性 Wistar 大鼠 240 只,分别在 1517 m 和 3848 m 海拔高度随机分为延迟复苏组(DFR, n=50),即时复苏组(IFR, n= 60) 和对照组(n=10), 建立总体表面积 30%的度烫伤模型,分别于伤后 1, 6, 12, 24, 72 和 168 h 取材.采用组织病理学、组织芯片技术、原位末端标记（TUNEL）法、免疫组织化学染色与图象分析技术,观察肺组织病理学改变与细胞凋亡及Bcl2 和 HI
2、F1 的表达. 结果: 随海拔的增加 ,肺泡壁明显增厚, 毛细血管内皮肿胀,肺泡腔中出现水肿液且有炎性细胞浸润,DFR 组较IFR 组差异有统计学意义(P0.05),肺泡上皮细胞凋亡逐渐增多, 各海拔高度 DFR 组均较 IFR 组变化大(P0.05). Bcl2 与 HIF1的阳性表达均位于肺泡上皮细胞的细胞核或胞浆,其表达强度实验组高于对照组(P0.05),随海拔梯度上升 Bcl2 表达增强,各海拔高度 DFR 组 Bcl2 表达强度高于 IFR 组（P0.05）. 细胞凋亡与Bcl2 和 HIF1 表达强度的变化呈正相关(r=0.872,0.945,P0.05). 结论: 高原地区严重烫
3、伤延迟复苏大鼠肺组织细胞凋亡数量随海拔梯度升高而增加,Bcl2 和 HIF1 对细胞凋亡具有调节作用. 2【关键词】 烧伤；复苏术；肺泡/细胞学；上皮细胞；TUNEL；HIF1 ；组织芯片；免疫组化；高原0 引言近年的研究表明, 多种脏器在发生缺血再灌注损伤时会出现细胞凋亡1-2,但对于高海拔地区严重烫伤延迟复苏后大鼠肺组织的细胞凋亡及其基因调控机制,尚无文献报道.本实验通过建立高海拔地区大鼠严重烫伤延迟复苏模型,应用组织芯片技术3-4 、原位末端标记技术、免疫组织化学染色和图象分析技术, 研究高海拔地区严重烫伤延迟复苏大鼠肺组织细胞凋亡及其可能的调控机制.1 材料和方法1.1 材料健康雄性
4、Wistar 大鼠 240 只(兰州军区兰州总医院动物实验科提供), 体质量(25030) g, 致伤前 1 wk, 置室温 1925. 实验前 24 h 用电推推去背部被毛,单笼饲养.实验前 12 h 禁食、水. 10 mg/L 戊巴比妥钠(40 mg/kg) 腹腔注射麻醉 ,分别在中度高原(1517 m)和高原(3848 m)地区建立大鼠背部 30%度烫伤模型( 病理证实), 致伤条件为 90, 20 s. 每一海拔梯度随机分 3 组:即时复苏3组(IFR, n=60), 即刻腹腔注射等渗盐水 4 mL/kg; 延迟复苏组(DFR, n=50), 6 h 后腹腔注射等渗盐水 4 mL/kg
5、; 正常对照组(n=10), 模拟烫伤, 不补液 . 原位末端标记试剂盒 : TUNEL (3% H2O2, 柠檬酸缓冲液, TBS, 封闭液生物素化抗体和地高辛抗体, DAB 显色剂等) 由武汉博士德生物工程有限公司提供. HIF1:兔多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司), 工作浓度 1100; Bcl2：鼠单克隆抗体(北京中杉生物工程有限公司)工作浓度 1:100; SP 试剂盒(北京中杉生物工程有限公司, 武汉博士德生物工程有限公司); 彩色病理图文分析系统(同济医科大学千屏影像工程公司); 组织芯片制作仪(朝阳恒泰科技发展有限责任公司).1.2 方法1.2.1 取材伤后 1, 6,
6、 12, 24, 72, 168 h, 每组取 10 只动物, 将大鼠处死, 迅速开胸, 于肺尖部切取 0.5 cm0.5 cm0.5 cm 大小组织, 10%甲醛固定, 置 4 冰箱. 对照组同上述方法.1.2.2 组织芯片的制备应用组织芯片制作技术制备 42（67 ）点列阵的组织芯片, 即由实验组各时相点肺组织标本与相应海拔梯度对照组肺组织标本组成. 具体操作如下:所有标本经中性福尔马林固定, 5658 熔点石蜡包埋, 34 m 切片, 经苏木素 伊红染色, 复核病理诊断,并在切片上标记出典型的病变区域; 用组织芯片制4作仪的针孔芯针在无组织的空白蜡块上钻孔(直径 1.8 mm); 借助玻
7、片上的标记找准蜡块上的相应部位, 用组织芯针采集组织芯; 将组织芯转移到空白蜡块中相应的孔中, 如此反复将数百个组织芯整齐有序安插在空白的蜡块中, 就制成了组织芯片蜡块; 空位Marker 选用两个正常的肝脏组织, 位于芯片的一角.1.2.3 病理学观察将不同海拔高度实验组、对照组肺组织标本石蜡包埋、切片、HE 染色，显微镜下观察照像.1.2.4 免疫组织化学分析采用 SP 法免疫组织化学染色, 按试剂盒操作说明进行, DAB 显色 , 苏木素复染. 对照组用 PBS 液代一抗. 免疫组化定量分析: 每张切片随机选 5 个高倍视野, 测每个视野阳性信号平均灰度值. 反应免疫组化染色越深, 灰度
8、越小, 即阳性表达越高.统计学分析: 采用 SPSS10.0 统计软件,计量资料用 xs 表示;组间比较采用方差分析及 LSDt 检验;双变量相关分析采用 Pearson相关分析,=0.05.2 结果2.1 组织芯片整体观察 42 个点阵排列整齐, HE 染色无掉片、重叠和扭曲现象, 适合免疫组化染色的观察和结果的判定.52.2 不同海拔高度肺组织细胞凋亡的变化与正常对照组比较 IFR组与 DFR 组在各时相点表达均增强, 主要分布在肺泡上皮细胞的胞核. 定量分析示(表 1): DFR 组与 IFR 组在两个高度各时相点均高于对照组(P0.05); 同一海拔高度, DFR 组在 6, 12,
9、24 h 时相点, 其阳性表达强度均高于相对应的 IFR 组时相点(P0.05); 高海拔 DFR 组与 IFR 组的表达强度, 在 6, 12, 24 h 时相点, 强于低海拔 DFR 组与 IFR 组(P0.05).2.3 不同海拔高度肺组织 Bcl2 的变化与正常对照组比较, IFR 组与 DFR 组在各时相点表达均增强, 主要分布在肺泡上皮细胞的胞浆. 定量分析示(表 2): DFR 组与 IFR 组在两个高度各时相点均高于对照组(P0.05); 海拔 1517 m DFR 组与 IFR 组相比, DFR 组在 6, 12, 24, 72 h 时相点 , 其 Bcl2 表达强度均高于
10、IFR 组(P0.05); 海拔 3848 m DFR 组与 IFR 组相比, DFR 组 6 h 阳性表达最明显, IFR 组于 24 h 表达最明显; 高海拔 DFR 组与 IFR 组的表达强度在6, 12, 24, 72 h 时相点, 强于低海拔 DFR 组与 IFR 组(P0.05).2.4 不同海拔高度肺组织 HIF1 的变化正常对照组比较 IFR 组与 DFR 组在各时相点表达均增强, 主要分布在肺泡上皮细胞的胞核或胞浆. 定量分析示(表 3): DFR 组和 IFR 组在两个高度各时相点均高于对照组(P0.05); 同一海拔高度 DFR 组与 IFR 组相比, 前者在 6, 12
11、, 24, 72 h 时相点, 其 HIF1 表达强度均高于相对应6的 IFR 组时相点(P0.05)；高海拔 DFR 组与 IFR 组的表达强度分别与低海拔 DFR 组与 IFR 组相比, 在 6, 12, 24, 72 h 时相点, 高海拔 DFR 组强于低海拔 DFR 组(P0.05).表 1 两个海拔烫伤后大鼠肺脏组织 TUNEL 标记细胞凋亡免疫组化灰度值的比较表 2 两个海拔烫伤后大鼠肺脏组织 Bcl2 免疫组化灰度值的比较(表 3 两个海拔烫伤后大鼠肺脏组织 HIF1 免疫组化灰度值的比较2.5 相关性分析细胞凋亡与 Bcl2 间呈正相关(r=0.872, P0.05)；细胞凋亡
12、与 HIF1 间呈正相关(r=0.945, P0.05).3 讨论Bcl2 是重要的抗细胞凋亡基因 , 在严重烫伤延迟复苏后肺损伤中表现得尤为突出, 本实验显示在海拔 1517 m, 伤后 12 h 在 DFR组肺泡上皮细胞即出现凋亡细胞, 与此同时, 相应位 Bcl2 呈高度表达, 表明肺脏组织在严重烧伤延迟复苏后的肺泡上皮细胞可能是通过 Bcl2 的过度表达来发挥其抗凋亡作用, 减轻细胞损伤. Bcl2 抗细胞凋亡的作用机制可能与以下几方面有关: 抑制 Ca2+的释放; bc12 通过阻止促进细胞凋亡基因信号传递或阻止这些诱导基因产物发挥作用; 细胞内抗氧化作用. 也有研究表明, Bcl2
13、 抗氧化作用是间接的, 即可能在于抑制超氧阴离子的产生而不是直接清除活性氧, 而 bc12 的这种抑制超氧阴离子的作用与其能抑制细胞色7素 C 的释放有关. 而在海拔 3848 m, 伤后 24 h DFR 组肺泡上皮细胞和中性粒细胞大量凋亡, 相应位 Bcl2 的表达却较弱, 表明高海拔地区缺氧及缺血再灌注损伤更易引起肺组织细胞的凋亡, 其机制为: 缺氧条件下 Bcl2 家族表达发生变化; 高海拔地区缺氧可通过降低 Bcl2 基因的表达来促进大鼠肺组织细胞凋亡的发生, 这与司少艳等采用 DNA 降解、TUNEL 法染色标记和 Bcl2mRNA 点杂交检测大鼠在慢性缺氧时胸腺细胞的增殖能力,
14、结果表明慢性缺氧可通过降低 Bcl2 基因的表达来促进大鼠胸腺细胞凋亡的发生相一致5; Bcl2 可抑制导致凋亡或坏死的活性氧形成, 还通过调节质子流出而阻断细胞凋亡; 缺氧诱导的凋亡主要是被抗凋亡蛋白过表达来阻滞的, 并且是以剂量依赖性的方式作用.HIF 1 是一种随细胞内氧浓度变化而调节基因表达的快速转录因子. 我们实验表明在高海拔地区严重烧伤延迟复苏后, 缺血、缺氧诱导了 HIF 1 的表达，提示 HIF1 参与了不同海拔严重烧伤延迟复苏后肺损伤的过程, 促进了肺组织细胞的凋亡. 目前认为, HIF1 表达增强, 促进肺组织细胞凋亡的机制可能与低氧、缺血再灌注状态下细胞线粒体产生大量的活
15、性氧,以及与缺血再灌注后产生的 OH 有关, 它们能够稳定 HIF1, 使 HIF1 免于被迅速降解. 低海拔正常对照组 HIF1 在肺泡上皮细胞不表达,是由于正常细胞在常氧环境中, HIF1 的半衰期极短, 产生之后迅速被泛素化, 继而由蛋白酶溶解6 .8综上所述, 不同海拔地区严重烫伤延迟复苏后可以引发肺组织细胞坏死和凋亡,其细胞凋亡的产生可能与 Bcl2 和 HIF1 基因蛋白的过量表达有关.【参考文献】 1 Yang J, Jones SP, Suhara T, et al. Endothelial cell overexpression of fas ligand attenuate
16、s ischemiareperfusion injury in the heart J. J Biol Chem, 2003, 278(17): 15185-15191.2 Padosch SA, Popp E, Vogel P, et al. Altered protein expression levels of Fas/CD95 and Fas ligand in differentially vulnerable brain areas in rats after global cerebral ischemia J. Neurosci Lett, 2003, 338(3): 247-251.3
