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1、分类号：密级：学位类别： 圄R 6 1 4科学学位口专业学位团学校代码：10062学号：2 0 1 0 6 0 2 7 5 4学科门类：医学 又肄酱科矢峥 T l A N J I 鞫黻O I C A LU N I V E R S l 彳Y硕士学位论文M A S T E R SD I S S E R T A T I O N论文题目：环腺苷酸一蛋白激酶A 在内毒素休克肺损伤时诱导大鼠血红素加氧酶一1 上调中的作用T I T L EE f f e c t o fc A M P - - P r o t e i nK i n a s eAo nu p r e g u l a t i n gh e m e
2、o x y g e n a s e 一1 i n d u c e db yl i p o p o l y s a c c h a r i d ei na c u t el u n gi n ju r yi nr a t sw i t he n d o t o x i ns h o c k 一级学科：临床医学二级学科：麻醉学论文作者：马冬梅指导教师：余剑波教授天津医科大学研究生院二O 一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，与我
3、一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：邋日期：侈椭| 同学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。本论文属于保密口，在年解密后适用本授权书。不保密怔五。( 请在相对应的方框内打“)学位论文作者签名：导师签名：1 3 年朗f 同3 年功f 同大津医科人学硕十学位论文中文摘要目的：严重的内毒素血症引起的器官衰竭是临床成人及儿童
4、病人死亡的主要原因之一。肺脏是内毒素攻击的主要器官，有证据表明4 0 的严重内毒素血症病人会引起肺损伤甚至急性呼吸窘迫综合症( A R D S ) 。内毒素对肺通气和循环功能引起显著改变，包括肺部炎症的扩散和肺血管内皮组织的损伤等。血红素氧合酶( H O ) 是血红素降解过程中的一种限速酶，血红素加氧酶1 ( H O 1 ) 为其诱导形式，广泛存于机体组织和细胞内，是生物体内较易被诱导的抗氧化酶类，应激、创伤、低氧等因素均可诱导其表达，发挥抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡等细胞保护作用。尽管大量研究表明在急性肺损伤( A L l ) 等多种肺部疾病中，H O 一1 表达上调发挥着强大的防御作用和极具潜
5、力的治疗作用，但其内源性保护机制至今尚未完全阐明。环腺：瞥酸依赖的蛋白激酶A ( c A M P P K A ) 简称P K A ，是细胞内一类重要的信息传导途径，并且在细胞增熵、分化、离子转运、新陈代谢及基因表达调控中起着重要作用。P K A 是H O l 信号传导通路之一，研究表明在大鼠原代肝细胞、小鼠巨噬细胞R A W 2 6 4 7 等多种器官细胞中P K A 可诱导H O 一1 的表达。本文通过建立大鼠内毒素休克肺损伤模型，从分子水平到基因水平拟探讨环腺苷酸蛋白激酶A 在大鼠内毒素休克肺损伤时血红素加氧酶1 表达上调中的作用，在内毒素性肺损伤的内源性保护机制方面提供新的思路和方法。方
6、法：健康清洁级雄性S D 大鼠4 8 只，体重2 0 0 2 2 0 9 ，2 5 3 0 月龄，采用随机数字表法随机分为4 组( n = 1 2 ) ：F 常对照组( C 组) ：左股静脉注射生理盐水( L P S 溶媒) O 5m l ，2 h 后皮下注射生理盐水( H 8 9 溶媒) O 5 m l ；内毒素休克肺损伤组( A L I 组) ，左股静脉注射L P S ( 1 0m g k g ) O 5m l ，2 h 后皮下注射生理盐水O 5 m l ； 内毒素休克肺损伤+ 抑制剂组( A L I + H 组) ：左股静脉注射L P S ( 1 0m g k g ) 0 5m l 2
7、h 后皮下注射H 8 9 ( 5 m g k g )o 5 m l ；抑制剂组( H 组) ：左股静脉注射生理盐水0 5m 1 ，2 h 后皮下注射H 8 9 ( 5 m g k g ) O 5 m l 。C 组、H 组首次注射至6h 时，A L I 组与A L I + H 组首次注射L P S 至6 h 时处死大鼠取肺组织，行病理学评分，测定肺组织含水率；应用W e s t e r nb l o t 法测定肺组织H O 1 和P K A 表达；采用R T - P C R 法测定肺组织H O 一1m R N A 表达。大津医科人学硕十学位论文结果：与C 组比较，A L l 组和A L I +
8、H 组肺组织含水率升高，肿组织损伤病理学评分升高，P K A 、H O 1 蛋白和H O 一1 m R N A 表达上调( P 0 0 5 ) ；与A L l 组比较，A L I + H 组肿组织含水率升高，肺组织损伤病理学评分升高，P K A 、H O 1 蛋白和H O - 1 m R N A表达下调( P O 0 5 ) ；与C 组比较，A L I 组大鼠含水率明显升高( J P O 0 5 ) ；与C 组比较，A L I 组、A L I + H 组H O 1 与P l 蛋白表达上调( P O 0 5 ) ；与A L I 组比较，A L I + H 组H O 一1 与P K A 蛋白表达下
9、调( P O 0 5 ) ，见图5 ，表8 。l8大沣医科人学硕十学位论文l ，K CAL IA L I + HHp a cf in 捌嘲湖豳鞠纂黪镧黼嘲嬲嘲蝴蝴懒嘲蝴麟斓嬲期黼黛麓暮童3 名昌I。e2 善专。竺名 言邕o ( ： l ，lA l ，II l I1C r ) U I - sI lCA L lA L I + HH1 一a c t i n _ _ - l _ - _ _ - _ _ 眇CA L I 氏L I + HH4G r o u p s图5 各组P K A 、H O 一1 蛋白的表达量：I 为P K A 蛋白免疫印记图；I I 为H O 1 蛋白的免疫印记图与C 组比较，“P
10、0 0 5 ，与A L I 组比较“P 0 0 5 ，与A L I + H 组比较P 0 0 51 92O8642OcH一。霄【口一IJH一。I岛 【l o = oo=日h；卜大津医科人学硕十学位论文表84 组人鼠肺组织H O 1 、P K A 蛋白与H O 1 m R N A 表达水平的变化( n ：1 2X S )与C 组比较，8 P 0 0 5 ，与A L I 组比较“尸 0 0 5 ，与A L I + H 组比较尸 0 0 54R T - P C R 结果( 1 ) 分光光度计法测定组织中总R N A 样品的浓度及纯度结果测定实验大鼠肺组织总R N A 样品的浓度。该样品在紫外分光光度
11、仪2 6 0 2 8 0 n m 处的O D 比值为2 0 5 ，2 6 0 2 3 0 n m 处的O D 比值为1 7 9 ，R N A 的浓度为1 0 4 5 5 n g I ，t l ，提示用T R I Z O L 提取R N A 获得适量较高浓度的总R N A 。( 2 ) 琼脂糖凝胶电泳检测组织中总R N A 样品的完整性结果所提取大鼠肺组织总R N A 样品经琼脂糖凝胶电泳观察，清晰可见2 8 S 、1 8 s 、5 S3 2 S 四条R N A 带。可认为总R N A 完整性较好，符合下一步反应的要求。( 3 ) I m P C R 扩增结果对各组大鼠肺组织中H O 1 m R
12、 N A 表达水平进行相对定量研究。测定目的基因及内参基因相对实时定量P C R 扩增曲线。通过比较阈值法对数据进行统计学分析，结果见表8 图6 。与C 组比较，A L l 组、A L I + H 组m R N A 表达上调( P 0 0 5 ) 。与A L l组比较，A L I + H 组m R N A 表达下调( P 0 0 5 ) 。C 组与H 组之间比较差异无统计学意义。( 4 ) 4 组大鼠肺组织H O 1 m R N A 表达水平的变化2 0天津医科人学硕十学位论文CA L IA L I + HH4G r o u p s图64 组大鼠肺组织H O 一1 m R N A 表达水平的比
13、较 与C 组比较，“P 0 0 5 ，与A L l 组比较“P 0 0 5 ，与A L I + H 组比较。P O 0 5讨论1 大鼠内毒素休克肺损伤模型建立1 1 实验动物选择用于内毒素休克肺损伤研究的实验动物种类以大鼠最为多见，本研究选用S D 大鼠，性情较W i s t a r 大鼠较为凶猛但对疾病的抵抗力较强，尤其对呼吸道疾病的抵抗力很强。可以避免大鼠本身易患肺损伤相关疾病对实验结果造成影响。1 2 建立内毒素休克肺损伤模型建立内毒素休克肺损伤动物模型的方法甚多，在实验室常采用内毒素直接注射、细菌攻击、局部脓毒病灶、盲肠结扎并穿孑L ( C L P ) 或肠系膜动脉央闭等制造内毒素休克
14、模型。脂多糖( L P S ) 为革兰氏阴性菌外膜的主要成分，是产525l5O21Oz配国HIoO昌oHhljIH大沣医科人学硕十学位论文生内毒素休克的主要病因。参照文献 1 7 介绍的方法本研究采用股静脉注射1 0m g k gL P S ( 溶于O 5m l 生理盐水) ，制备大鼠内毒素休克肺损伤的模型。结果表明注射后大鼠出现腹泻，竖毛和萎靡等征象，2 h 时M A P 下降至实验前的7 5 左右，2 小时点测动脉血气，氧和指数小于3 0 0 。内毒素给药6 h 时光镜下可观察到大鼠肺组织病理损伤明显，损伤肺组织病理学评分、肿含水率升高，H O 1 与P K A 蛋白表达增加，表明模型制备
15、成功。本研究参照文献 1 8 并结合预实验结果选择皮下注射P K A 抑制剂5m g k gH 8 9 ( 溶于O 5m l 生理盐水) 抑制P K A 活化。2H O 1 与内毒素休克肺损伤( 1 ) H 0 一l 的生物学特征H O 1 是血红素降解过程中的限速酶，将血红素分解为一氧化碳( C O ) 、游离铁和胆绿素，胆绿素随即被还原酶还原成胆红素l l 引，见图7 。目i 订已证实H O 有三种同工酶：H O l 、H O 一2 、H O 一3 ，H O 一1 为H O 的诱导型。H O 一1 基因中有4 个内含子和5 个外显子，不同生物H O 一1 基因的5 端有相应的调节元件，包括
16、缺氧诱导反应元件( H R E ) 、应激反应元件( S t R E ) 、热休克反应元件( H S E ) 币H金属反应元件( M T R E ) 等1 2 。不同的转录因子与这些元件结合产生不同的作用。H O 1 启动子有多种顺式作用调= 育元件( R E S ) ，有两个增强子区E 1 和E 2 ，他们在氧化还原反应中起到重要作用【2 1 1 。H O 一1 广泛存在于内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞及其他类型的细胞中。H O 一1 因其抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡和抗移植排斥反应的功能在多种疾病中对人体起到保护作用，其分解血红素的三种产物对免疫调节，抗细胞凋亡，和血管活性作用已被广泛研究2 2 11 2 3 1 。产物之一C O 虽然有潜在的毒性，但其作为被环腺苷酸鸟苷(
