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1、 生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2011, September 25; 27(9): 13171325 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 2011 CJB, All rights reserved. Received: January 19, 2011; Accepted: April 20, 2011 Supported by: Qianjiang Talent Program of Zhejiang Province (No. 2009R10048), Scientific Research Foun
2、dation of Zhejiang University of Technology (No. 20090172). Corresponding author: Zhao Wang. Tel/Fax: +86-571-88320781; E-mail: 浙江省钱江人才计划 (No. 2009R10048)，浙江工业大学校基金 (No. 20090172) 资助。 工业生物技术 荧光假单胞菌短链脱氢酶的克隆、表达及酶学性质分析 薛群，应向贤，杨池，汪钊 浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州 310014 摘 要: 为了研究荧光假单胞菌中短链脱氢酶的生理角色和催化特性，从荧光假单胞菌 Pseu
3、domonas fluorescens GIM1.49 基因组 DNA 克隆表达了一个短链脱氢酶的编码基因 pfd，并分析了该基因产物的酶学性质。基因 pfd 全长684 bp，编码 227 个氨基酸，推算分子量为 24.2 kDa。将携带短链脱氢酶基因的重组质粒 pET28b-pfd 转入大肠杆菌BL21(DE3) 进行表达， 得到了 28 kDa 的表达产物。 重组荧光假单胞菌短链脱氢酶 (PFD) 能氧化 4-氯-3-羟基丁酸乙酯、1-苯乙醇、苯甲醇、仲丁醇和还原 4-氯-乙酰乙酸乙酯、2-溴-苯乙酮、4-溴-苯乙酮等底物。以 4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物时活力最高，Km值为 186.
4、90 mmol/L，Vmax为 89.56 U/mg。氧化 4-氯-3-羟基丁酸乙酯时，最适反应温度和 pH分别为 12 和 10.5，倾向于利用 NAD+作辅酶；而还原 4-氯-乙酰乙酸乙酯时，最适温度和 pH 为 24 和 8.8，倾向于利用 NADPH 作辅酶。重组 PFD 能耐受 50 (V/V) 的甲醇等有机助溶剂，Ca2+ (1 mmol/L) 和 EDTA (5 mmol/L) 对其酶活有一定的促进作用。上述结果表明，重组 PFD 是一个新型的短链脱氢酶，其代谢角色推测与卤代次级醇的氧化降解有关。 关键词: 短链脱氢酶，荧光假单胞菌，克隆与表达，酶学性质 Cloning, exp
5、ression and characterization of a short-chain dehydrogenase from Pseudomonas fluorescens Qun Xue, Xiangxian Ying, Chi Yang, and Zhao Wang College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China Abstract: To explore the physiological role and bio
6、catalytic properties of short-chain dehydrogenases from Pseudomonas fluorescens GIM1.49, we cloned the structural gene pfd and characterized its over-expressed product. The length of gene pfd was 684 bp encoding a short-chain dehydrogenase with 227 amino acid residues and calculated molecular mass o
7、f 24.2 kDa. The recombinant plasmid pET28b-pfd was constructed and functionally expressed in Escherichia coli BL21(DE3), resulting in the over-production of recombinant short-chain dehydrogenase PFD with a size of 28 kDa. The enzyme could oxidize alcohols including 4-chloro-3-hydroxbutanoate ester a
8、nd reduce 4-chloro-acetoacetate ester using either NAD(H) or NADP(H) as coenzyme. The enzyme showed the highest activity against 4-chloro-3-hydroxbutanoate ester as substrate, with Km of 1318 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech September 25, 2011 Vol.27 No.9 J 186.90 mmol/L and Vmax of 89.56 U/
9、mg. When catalying the oxidative reaction, its optimal temperature was 12 C and optimal pH was 10.5, in contrast to the values of 24 C and pH 8.8 in the reductive reaction. The enzyme had high solvent tolerance and its activity was improved by the addition of Ca2+ (1 mmol/L) or EDTA (5 mmol/L). Thes
10、e results indicated that the enzyme from Pseudomonas fluorescens GIM1.49 was a novel short-chain dehydrogenase and might play a role in oxidative degradation of halogenated secondary alcohols. Keywords: short-chain dehydrogenase, Pseudomonas fluorescens, cloning and expression, enzyme properties 短 链
11、 脱 氢 酶 / 还 原 酶 家 族 (Short-chain dehydrogenases/reductases，SDRs) 是最大的酶家族之一，包括具有不同催化功能的氧化还原酶、异构酶和裂解酶等多个亚家族成员，其生理功能涉及糖、醇、脂类、氨基酸、碳氢化合物、辅酶、荷尔蒙、 异生物质等多种代谢1-2。 短链醇脱氢酶是 SDRs中最大的亚家族，催化醇的氧化或醛、酮的还原。假单胞菌具有降解芳香烃和长链烷烃的能力，可应用于海水、淡水或土壤等环境中石油污染的生态修复3-4。 Kirschner 等4研 究 发 现 荧 光 假 单 胞 菌Pseudomonas fluorescens DSM 5010
12、6 的一个短链醇脱氢酶能氧化 2-癸醇等长链次级醇，是该菌烷烃降解代谢途径中的关键酶之一。此外，荧光假单胞菌P. fluorescens Pf-5 基因组信息表明含有 27 个 SDR编码基因5，而这些 SDR 基因在胞内生理代谢中所扮演的具体角色还有待解析。 短链脱氢酶也是一类在生物催化与转化上备受关注的生物催化剂。SDRs 往往具有较宽的底物谱，其底物包括异丙醇等小分子以及糖醇、芳香醇等大分子6-7，而对大分子底物的催化和转化正是当前生物化工中的难点之一。戴小燕等8报道了氧化葡萄糖酸杆菌的一个短链脱氢酶能可逆的催化 D-阿拉伯糖醇氧化为 D-木酮糖。Pennacchio 等9从 Sulfo
13、lobus acidocaldarius 中克隆表达了一个热稳定的短链脱氢酶，该酶能氧化扁桃酸甲酯、环己醇、1-苯乙醇、1-茚醇等大分子醇。SDRs 还具有优良的立体选择性，可用于作为药物中间体的多种手性醇的不对称合成10-15。然而，这些酶普遍活力较低，限制了其在生物催化与转化中的进一步应用。 为了获得高活力的短链脱氢酶，本研究从荧光假单胞菌株 P. fluorescens GIM1.49 中扩增出短链脱氢酶基因 pfd，在大肠杆菌 BL21(DE3) 中实现了功能性表达，对其酶学性质进行了研究，并探讨了重组荧光假单胞菌短链脱氢酶 (PFD) 的生理生化功能及应用潜力。 1 材料与方法 1.
14、1 材料 1.1.1 菌种及质粒载体 荧光假单胞菌 (P. fluorescens GIM1.49) 购自广东微生物菌种保藏中心。 表达载体 pET-28b、 大肠杆菌 Escherichia coli DH5 与 E. coli BL21(DE3) 均为本实验室保藏。 1.1.2 试剂 rTaq 酶购自上海申能博彩生物科技有限公司。T4 DNA 连接酶、限制性内切酶为 Fermentas 的产品。DNA marker、克隆载体 pMD-18T、基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、琼脂糖电泳试剂均购自大连 TaKaRa 公司。Ni-NTA Sefinose Kit 购自 Bio B
15、asic INC 公司。其余试剂均为国产分析纯。 1.1.3 培养基及培养条件 大肠杆菌 E. coli DH5 与 E. coli BL21(DE3) 采用 LB 培养基，37 下过夜培养。荧光假单胞菌采用营养肉汁培养基，30 下培养 24 h。重组克隆菌株用含 50 mg/L 氨苄青霉素、24 mg/L 异丙基-D-硫代半乳糖苷 (Isopropyl -D-thiogalactoside， IPTG)、40 g/mL 5-溴 -4-氯 -3-吲 哚 -D-半 乳 糖 苷 (5- Bromo-4-chloro-3-indolyl -D-galactoside， X-Gal) 的LB 培养基进行筛选，重组表达菌株用含 100 mg/L薛群等: 荧光假单胞菌短链脱氢酶的克隆、表达及酶学性质分析 1319 J 卡那霉素 (Kanamycin，Kan) 的 LB 培养基进行筛选，并用终浓度为 0.3 mmol/L IPTG 诱导培养。 1.1.4 引物 菌株 P. fluorescens GIM1.49 的 16S rDNA 序列委托上海生工生物工程有限公司测定，测序结果表明它与 P. fluorescens Pf-5 的 16S rDNA 序列同源性为 100。根据 P. fl
