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1、华中科技大学博士学位论文真核表达质粒pcDNA3.1-PTEN的构建及PTEN基因稳定转染对乳 腺癌MDA-MB-468细胞的生长抑制作用姓名：陈庆永申请学位级别：博士专业：外科学，普外指导教师：陈道达2003.5.1兰! 型垫查堂堕塑墨兰堕J 堡上堂篁! ! 二! 二B S AD M S 0 H E P E S缩略词表B o v i n es e r u ma l b u m小牛血清白蛋白D i m e t h y ls u l f o x i d e二甲基亚砜N - 2 - h y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - N7 - - 2 一e
2、t h a n e s u l f o n i ca c i dN 2 羟乙基哌嗪一N 一2 一乙磺酸L o s so f h e t e r o z y g o s i t y杂合性缺失M M A C IM u t a t e di nm u l t i p l ea d v a n c e dc a n c e r sP 1 3 KP h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 一3 一K i n a s e磷酯酰肌醇一3 一激酶P I P 3P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 , 4 ，5 一t r i s p
3、 h o s p h a t e磷酯酰肌醇一3 ，4 ，5 一三磷酸P K BP r o t e i nK i n a s eB蛋白激酶BP T E NP h o s p h a t a s ea n dt e n s i nh o m o l o gd e l e t e do nc h r o m o s o m e10T E P lT G F r e g u l a t e da n de p i t h e l i a lc e l l - e n r i c h e dp h o s p h a t a s eR T - P C RR e v e r s et r a n s c r
4、 i p tp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n逆转录一聚合酶链式反应牛中科技人学同济医学院博士学位论文真核表达质粒p c O N h 3 卜P T E N 的构建及外源性P T E N 基因稳定转染对乳腺癌细胞株M D A 一皿一4 6 8细胞的生长抑制作用华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科，武汉，4 3 0 0 2 2博士研究生：陈庆永博士生导师：陈道达中文摘要 f ，乳腺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，基因治疗可能成为那些已丧尖手术时机患者的第五大治疗手段。乳腺癌的基因治疗，要想取得突破性的进展，有赖于发现更多，更有效的靶点，采用多
5、基因联合治疗。因此，寻找新的针对乳腺癌的目的基因是亟待研究的课题。通过基因转染抑制肿瘤细胞增生，诱发肿瘤细胞凋亡，是肿瘤基因治疗策略所在，而阻断肿瘤细胞凋亡抑制信号通路是抑制生长的重要途经。而P T E N 是自1 9 9 7 年以来发现的定位于人类染色体l O q 2 3 的肿瘤抑制基因，由于它对P 1 3 K A K T 凋亡抑制通路具负调控作用，使其成为继P 基因之后与各种肿瘤密切相关的抑癌基因。因此，我们认为，乳腺癌的P T E N 表达状况的研究是极具研究价值的课题，P 1 3 K - A K T 通路与乳腺癌的生长密切相关，那么，我们有理由认为，作为P 1 3 K A K T 通路
6、的负调控因子，P T E N 基因可能成为乳腺癌基因治疗更具针对性的目的基因，对于乳腺癌有否P T E N 表达异常，野生型P T E N 基因转染对乳腺癌生长的生物学作用及其机制，对于揭示乳腺癌的发病机理，并寻找针对这一顽疾的新的治疗策略，具有十分重大的兰! 型垫叁兰旦堕墨兰堕堕主兰垡堡茎，、 意义。有鉴于衅本研究采用乳腺癌标本，研究乳腺癌P T E N 表达状况以揭示其在乳腺癌病因学上的意义。进而采用野生型P T E N 转染乳腺癌细胞株，研究P T E N 是否对乳腺癌细胞体外生长具有抑制作用极其机制。为此我们进行了以下三部分实验研究。第一部分多功能P T E N 基因在乳腺癌中的表达及
7、其临床意义【摘要目的研究乳腺癌中P T E N 的表达与乳腺癌不同的临床病理因 素、T N M 分期的关系及其l 描床意义。方法采用免疫组织化学s P 法，对3 2 例乳腺癌组织中P T E N 蛋白的表达水平进行检测。结果正常乳腺组织中P T E N 表达阳性，有腋淋巴结转移的乳腺癌组织中P T E N 表达水平显著低于无腋淋巴结转移的乳腺癌组织( p 0 0 5 ) ，见附图】一3 ，见表1 表1乳腺癌不同临床病理因素中P T E N 的平均光密度1 6 华中科技人学同济医学院博I 学位论文讨论癌变是一种多因素、多阶段和多基因的过程。随着肿瘤分子病理学研究的深入，癌基因和抑癌基因在肿瘤发生
8、和发展中的作用及地位已引起人们越来越多的关注，更多的癌基因或抑癌基因被发现和认识。P T E N M M A C 就是由3 个由研究小组于1 9 9 7 年发现的第一个具有磷酸酯酶活性的抑癌基因。研究表明，P T E N M M A C 基因在多个进展期肿瘤中均有突变。4 。M y e r s “3 等研究发现P T E N M M A C ，编码蛋白对磷酸化的丝氨酸苏氨酸残基均有去磷酸化作用。蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍、也是最重要的机制。催化蛋白质磷酸化的磷酸酯酶成为信号转导机制和控制细胞生长的关键分子”1 。因为大多数蛋白酪氨酸磷酸激酶的功能是刺激和促进细胞生
9、长，比如众多的生长因子的受体，所以从理论上来讲，至少一部分的酪氨酸磷酸酶的功能是抑制细胞生长。这部1 7 华中科技大学司济医学院博I 学位论艾分磷酸酶基因的失活应会导致细胞过度生长和产生肿瘤”。最近P T E N M M A C 基因的克隆证实这一推断的可能性，其编码的蛋白在酪氨酸磷酸酶和丝氨酸苏氨酸磷酸酶介导的信导转导过程中具有重要的作用。P T E N 是1 9 9 7 年在染色体l O q 2 克隆到的1 个基因，含9 个外显子和8 个内含予，其读码框架中有一段与酪氨酸磷酸化酯酶( p r o t e i nt y r o s i n ep h o s p h a t a e s ，P
10、T P ) 和酪氨酸双特异磷酸酯酶( d u a ls p e c i f i c i t yp h o s p h a t a s eD S P ) 的催化中心同源序列相匹配的功能域，并有一段氨基酸序列细胞骨架蛋白t e n s i n 同源。体外实验显示P T E N 蛋白的磷酸酯酶活性可使磷酸化的丝苏氨酸和酷氨酸残基去磷酸化，与细胞内信息的传递有关，参与细胞生长、凋亡等调控过程。实验发现P T E N 在脑、甲状腺、乳腺、前列腺等肿瘤中常出现基因突变和异常表达，是这些部位肿瘤发生、发展的重要分子事件“1 。L i 等m 在体外和动物实验中发现，P T E N 基因缺失可促进乳腺细胞的癌变
11、。B r u n i 等“采用免疫组化和原位杂交技术，在散发性甲状腺癌组织中也发现P T E Nm R N A 和蛋白水平明显下降，与甲状腺癌的发生有关。P T E N 还是肿瘤细胞浸润和转移的重要负性调节因子。P T E N 失活或突变有助于肿瘤细胞浸润和转移的发生。目前有关P T E N 在乳腺癌组织中的表达及其生物学意义的研究很少。本组结果显示，正常乳腺组织中的P T E N 呈表达阳性，主要定位细胞浆，而乳腺癌组织中P T E N 蛋白的表达水平低，P T E N 蛋白的低表达是乳腺癌常见的分子事件，其可能参与乳腺癌的发生与发华中科技大学同济医学院博j j 学位论文展。本组分析结果发现
12、，P T E N 蛋白表达水平与乳腺癌组织E R 水平呈f 相关，与腋淋巴结转移呈负相关，说明P T E N 蛋白低表达病例，其肿瘤恶性程度较高，易出现浸润和转移。乳腺癌组织中P T E N 蛋白的表达水平低的原因尚不清楚，但研究表明P T E N 基因突变并不常见，其与肿瘤的密切关系可能由于其转录和翻译水平的调控异常，导致其表达紊乱，从而影响其J 下常功能，进一步研究乳腺癌P T E N 基因的突变及其表达规律将有重要意义。参考文献1 L iJ ，Y e nC ，L i a wD ，e ta 1 P T E N ，ap u t a t i v ep r o t e i nt y r o s
13、i n ep h o s p h a t e a s eg e n em u t a t di nh u m a nb r a i n ，b r e a s t ，a n dp r o s t a t ec a n c e lS c i e n c e ，1 9 9 7 ，2 7 5 ：1 9 4 3 1 9 4 7 2 G a r c i aJ M ，S i l v aJ M ，D o m i n g n e zG ，e ta 1 A l l e l i cl o s so ft h eP T E Nr e g i o n ( 1 0 q ) i nb r e a s tc a r c i
14、n o m a so fp o o rp a t h o p h e n o t y p e B r e a s tc a n c e rR e sT r e a t19 9 9 ；5 7 ：2 3 7 - 2 4 3 3 S t e c kP A ，P e r s h o u s eM A ，J a s s e rS Ae ta l 。I d e n t i f i c a t i o no f ac a n d i d a t et u m o rs u p p r e s s o rg e n e ，M M A C l ，a tc h r o m o s o m e1 0 q 2 3t
15、h a ti sm u t a t e di n m u l t i p l ea d v a n c e dc a n c e r s ，N a t G e n e t ，1 9 9 7 ，1 5 ：3 5 6 ，4 L i a wD ，E n gC ，P r a c o c k eM ，e ta 1 G e r m l i n em u t a t i o n so ft h eP T E Ng e n ei nC o w d e nd i s e a s e ，a ni n h e r i t e db r e a s ta n dt h y r o i dc a n c e rs y
16、n d r o m e N a tG e n e t 1 9 9 7 ，1 6 ：6 4 6 7 1 9 华中科技大学州济医学院博I ：学位论文5 P o d y s y p a n i n aK ，E l l e n s o nL H ，N e m e sA ，e ta 1 M u t a t i o no fP T E N M M A C li nm i c ec a u s e sn e o p l a s i ai nm u l t i p l eo r g a ns y s t e m s P r o cN a t lG e n e tU S A ，1 9 9 9 ，9 6 ：1 5 6 3 一1 5 6 8 6M y e r sM P , S t o l a r o vJ P , E n gC ，e ta 1 P T E N ，t h et u m o rs u p p r e s s o rf r o mh u m a nc h r o m
