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1、复旦大学博士学位论文通过改变Smad4的表达研究BMP7-Smad4-Id2信号通路在大肠癌 发生发展中的作用及其机制姓名：时强申请学位级别：博士专业：外科学（普外）指导教师：姚礼庆2012-03-31复旦大学博士毕业论文中文摘要通过改变S m a d 4 的表达研究B M P 7 S m a d 4 I d 2 信号通路在 大肠癌发生发展中的作用及其机制中文摘要第一部分S m a d 4 蛋白在大肠癌组织中的表达及临床意义【摘要】目的：探讨S m a d 4 蛋白在大肠癌组织中的表达及其与患者临床、病理之间的关系。方法：利用免疫组化S - P 法检测6 0 例大肠癌组织、2 7 例癌旁正常组
2、织中S m a d 4 的表达；回顾性收集相应患者的临床病理资料。结果：S m a d 4 在大肠癌原发灶中的免疫组化切片评分，与癌旁正常组织相比，采用M a n n W h i t n e y 检验，U ：2 9 4 5 0 ，有显著性差异( P O 0 5 ) ，与肿瘤的浸润层次( T 分期) ，淋巴结转移，D u k e s 分期有关( P O 0 5 ) ；正常结肠黏膜与腺瘤比较，S m a d 4 蛋白的表达差异不明显( P ) O 0 5 ) 。表明S m a d 4 可能具有抑制大肠癌细胞生长及抑制大肠癌浸润和转移的作用，提示S m a d 4 可能参与了大肠癌的演进过程。郑林乜
3、2 1 等实验发现与癌旁黏膜相比，大肠癌组织的S m a d 4 表达下降。中、低分化大肠癌其S m a d 4 的表达较高分化肿瘤显著下降，D u k e s B 和C D 期患者的S m a d 4 表达也明显减少，这表明S m a d 4 的表达与肿瘤分化程度及D u k e s 分期相关。谢忠士心踟等应用免疫组化法，对8 0 例大肠癌及2 8 例癌周黏膜进行检测，并结合临床资料进行研究。结果大肠癌I X ，S m a d 4 蛋白的表达阳性率为7 5 ( 6 0 8 0 ) ，2 8 例癌周黏膜内癌S m a d 4 蛋白均呈强阳性表达，两者比较差异有显著性意义( P 0 0 5 )
4、。由此可见，S m a d 4 基因在大肠癌癌变的启动、促进、发展或转移等阶段均起着重要的作用。与以上文献的结果基本符合。同时也说明检测S m a d 4 蛋白在大肠癌组织中的表达，对预测大肠癌的预后也重要的意义。骨形态发生蛋白( b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n s ，B M P s ) 家族属于转化生长因子1 3 ( T G F B ) 超家族，在胚胎细胞的生长分化，骨骼的发生和生长过程中起重要作用。但近年来有越来越多的证据显示在消化道恶性肿瘤中，B M P 7 因子表达明显升高，并且在肿瘤细胞侵袭转移过程中起重要的促进作用。通过对
5、临床大肠癌标本的检测，我们前期实验发现和正常黏膜组织相比，大肠癌组织中的B M P 7 m R N A和蛋白的表达均明显升高，并且B M P 7 m R N A 的表达与肿瘤侵润深度、是否有淋巴结转移、是否有肝转移以及D u k e s 分期明显相关n 1 | 。I d 因子是转化生长因子B ( T G F 一1 3 ) 家族下游重要的效应因子，也是碱性螺旋一环一螺旋( b a s i ch e l i x l o o p h e l i x ，b H L H ) 因子的内源性负性调节因子。与I d s 结合的具有特征性的b H L H 蛋白包括广泛表达的E 蛋白( E 1 2 、E 4 7
6、、E 2 - 2 和H E B ) 和组织特异性的蛋白质( 如在肌肉中表达的M y o D 和在神经组织中表达的N e u r o D ) m 3 。而E 蛋白可促进其下游目的基因的表达，这些下游目的基因包括细胞周期的负性调控因子P 2 1 C I P W A F l ，P 1 5 I N K 4 B 和P 1 6 I N K 4 B 瞳7 侧。I d 因子正是通过抑制E 蛋白与D N A 的结合，进而抑制其下游的细胞周期负性调控因子，促进细胞的增殖。在I d 家族中最受关注，作用最广泛的是I d 2 因子。我们的前期实验通过对大肠癌标本中的I d 2 、I d 3 因子进行检测发现只有I d
7、 2 因子表达明显升高。且I d 2 的表达量与肿瘤浸润深度及肝转移明显相关，这一结论与G r a yM J 等的研究结果基本相符，他们发现临床大肠癌病灶中I d 2 表达较低的患者肿瘤转移率较低，预后较佳幢引。工d 家族与T G F B 家族关系密切，是T G F 一1 3 家族重要的下游分子。T G F B 可明显抑制I d 因子的表达，而B M P 具有较强的诱导I d 表达的能力口引。我们的前期复旦大学博士毕业论文第一部分实验发现在大肠癌组织中I d 2m R N A 的表达与B M P 7m R N A 的表达明显相关，蛋白的表达也呈现正相关。即在肿瘤组织中B M P 7 和I d
8、2 均增加。我们的本次实验结果显示，S m a d 4 的表达与B M P 7 成负相关，与I d 2 的表达也成负相关。结合上述前期实验的结果，初步提示S m a d 4 的表达异常导致B M P 7 信号通路的紊乱，使I d 2 失去B M P 7 的调节，I d 2 表达增加，使细胞逃避生长抑制效应，并且促进肿瘤的转移，在大肠癌的复发转移过程中起到了重要作用。另外，S m a d 4的缺失，使B M P 7 不能通过B M P 7 一S m a d 4 途径发挥作用，但因为自分泌的原因，B M P 7的表达仍不断增加，并可能通过其他途径或B M P 7 本身直接促进肿瘤的生长。为证实以上
9、想法，我们进行以下实验。主要是通过干扰S m a d 4 的表达，来验证B M P 7 是否是通过S m a d 4 途径对I d 2 进行调节，从而发挥对大肠肿瘤发生发展的作用的。这对了解大肠癌浸润、转移有重要的意义，同时也为临床提高大肠癌疗效提供了一条新的思路。4 结论( 1 ) S m a d 4 在大肠癌肿瘤组织中低表达；( 2 ) S m a d 4 的表达与大肠癌的浸润深度，淋巴结转移情况，D u k e s 分期有关；( 3 ) S m a d 4 在大肠癌组织中的表达与B M P 7 的表达负相关，与I d 2 的表达负相关。附图：复旦大学博士毕业论文第二部分第二部分S m a
10、 d 4 表达下降对大肠癌细胞H C T I1 6 增殖性、迁 移性、侵袭性以及B M P 7 - S m a d 4 - I d 2 通路的影响( 体外实验)i 上_ - J L 刖吾外源导入的双链R N A ( d sR N A ) 可抑制细胞内同源m R N A 的降解，这一过程被称为R N A 干扰( R N Ai n t e r f e r e n c e ，R N A i ) 。R N A 干扰现象广泛存在于自然界，不同的有机体( 包括植物，真菌，线虫及哺乳动物) 均可利用R N A 干扰机制抵御病毒和转座子侵入机体基因组口1 I 。在哺乳动物细胞中，体外导入的s i R N A
11、可模拟d s R N A 的体内切割产物，以序列特异性地抑制细胞内同源基因的表达口2 。这一现象的发现，为阻断人体有害基因的表达提供了一个崭新的工具，s i R N A 有可能成为继反义核酸、核酶之后基因治疗的又一新武器。与传统的基因治疗药物相比较，s i R N A 具有两大明显的优势：即高特异性和高抑制率。s i R N h 与靶基因的一个碱基错配，即可导致其抑制作用失败。这对于特异性抑制同源性较高的基因( 如P K C 的不同亚型) 或具有点突变的癌基因( 如K - R A S 等) 提供了理想的工具。s i R N A 抑制基因表达的效率极高，甚至可完全阻断基因表达，效果接近基因敲除技
12、术口3 I 。B e r t r a n d 钔等比较了针对同一靶基因的反义寡核苷酸和s i R N A 的抑制效果，结果发现，与反义寡核苷酸相比，s i R N A 在体外细胞培养中具有更强且持续时间更长的抑制作用：而在体内实验中，仅观察到s i R N A 有一定的抑制活性。R N A 干扰技术在生命科学的多个领域展现了巨大的应用前景：如基因功能研究，基因调控研究、基因药物开发和基因治疗等口引。目前，在哺乳动物细胞中进行R N A 干扰研究常见的方法是将靶向特定基因的大约2 1 个核苷酸大小的小分子干扰R N A ( s m a l li n t e r f e r i n gR N A
13、，s i R N A ) ，或者是4 5 5 0 个碱基长短的发夹结构R N A ( s m a l lh a i r p i nR N A ，s h R N A ) 转染到细胞。s h R N A 在细胞内会自动被加工成为s i R N A ，从而引发基因沉默或者表达抑制。本部分实验设计出S m a d 4 的s h R N A ，以脂质体作为载体工具，将S m a d 4 一s h R N h带入细胞内并发挥抑制S m a d 4 基因表达的作用，从而研究，原本表达S m a d 4 基因的H C T l l 6 细胞中S m a d 4 的表达降低后，细胞的增殖性和侵袭性等细胞活性是否发
14、生改变。同时改变上游的B M P 7 细胞因子的作用量，在既往证实B M P 7 可以使表达S m a d 4 的H C T l1 6 细胞中I d 2 的表达增加的前提下，探讨H C T l1 6 细胞中S m a d 4 的表达降低后，B M P 7 细胞因子是否仍然会影响I d 2 的表达及是否影响细胞的增殖性和侵袭性。1 9复旦大学博士毕业论文第二部分1 材料与方法1 1 材料1 1 1 主要试剂名称厂家大肠癌细胞株H C T l l 6中国科学院细胞库购买中山医院中心实验室保存；S m a d 4 一s h R N A 质粒( 简写为：S m a d 4 - s h R N A )上
15、海吉凯基因化学技术有限公司；P G C S i H l n e o G F PN C 质粒( 简写为：H K )上海吉凯基因化学技术有限公司；M c C o y S5 A 培养液吉诺公司；P B S 缓冲液吉诺公司；胰酶( 含E D T A )吉诺公司：胎牛血清b i o w e s t ( 美洲) ；L i p o f e c t a m i n e 饼2 0 0 0 转染液I n v i t r o g e n 公司；O p t i M E MI 无血清培养液I n v i t r o g e n 公司；S m a d 4 鼠抗人多克隆抗体( S C 一7 6 9 9 )S a n t a
16、C r u z ；B M P 7 兔抗人多克隆抗体( a b 5 6 0 2 3 )A b c a m 公司；I d 2 兔抗人多克隆抗体( a b 5 2 0 9 3 )A b c a m 公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔I g G ( H + L )碧云天生物工程有限公司( 进口分装) ；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠I g G ( H + L ) 碧云天生物工程有限公司( 进口分装) ；T R h o lI n v i t r o g e n 公司；P r i m e S c r i p t T MR Tr e a g e n tK i t 反转录试剂盒T a K a R a 公司；S Y B RP r e m i xE xT a q T MR e a l T i m eP C R 试剂盒T a K a R a 公司：P C R 引物( S m a d 4 ，I d 2 ，G A P D H ，B a c t i n 引物)上海博彩公司； H R P E C L 发光检测试剂盒P i r e c e 公司：
