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1、蛙的催青和人工授精蛙的催青和人工授精一、目的要求一、目的要求 通过本实验,掌握中国虎纹蛙的催青及人工授精的操作技术,了解蛙从受精卵到变态 阶段的外形变化,进一步树立蛙胚发育中动态和立体的概念。 二、仪器药品二、仪器药品 注射器、培养皿、解剖剪、解剖镊子、解剖镜、显微镜、塑料桶、1000ml 的广口瓶、 吸管、放大镜、采集网。 LRH-A3(促黄体) 、HCG(商品名:多情素) 。 三、材料三、材料 虎纹蛙(Rana tigrina rugulosa) 四、方法四、方法 催青及人工授精催青及人工授精 1催青催青 把刚从野外捕捉到的蛙,选择雌蛙体长大于 75mm 和雄蛙体长大于 70mm 的性成熟
2、的 个体,放于水缸中。首先提高水温达到 1820C。取雌蛙,在腹腔注射 LRH-A(注射量每 只 35g 左右) ,hCG(注射量每只 2030 国际单位/ml),雄蛙的注射量可酌减一半。 具体配置方法:LRH-A(100g 每支)3 支加水配成 40ml 溶液,雌蛙剂量为 0.5ml, 雄蛙减半;HCG(每支 10000 国际单位)1 支加水配成 500ml 溶液,雌蛙剂量 1ml,雄蛙 减半。 将注射后的虎纹蛙分成 3 桶,A 桶 10 只雄蛙,B 桶 10 只雌蛙,C 桶 5 对雌雄。桶里 放少量水,将纸皮箱剪开洞口后盖住桶口,以重物压上,留出透气口的同时防止蛙逃窜。 2人工授精人工授精
3、 精子悬浮液的制备:先用剪刀将雄蛙腹中线剖开,露出黄色或褐色的精巢,用剪刀剪 下精巢,放入培养皿或研钵中。用弯头剪刀将精巢剪碎或用研钵轻轻研磨,再加适量生理 盐水,用玻璃棒搅拌均匀,即可制得精子悬浮液。 用左手握住催青后即将产卵的雌蛙,腹部向上,用右手拇指和食指由前向后轻轻挤压 腹部,卵即可由泄殖孔流出。把挤出的卵,收集在培养缸内,加入已制备好的精子悬浮液 摇匀,使精液和卵充分均匀接触,1015min 后更换净水,洗去多余精子,经几次换水后, 加入足量清水,以保证受精卵正常发育。 (三)胚胎发育的观察(三)胚胎发育的观察 取少许卵块,放在滤纸上轻轻滚动,以清除卵外之胶膜,再置于盛有清水的培养皿
4、中, 用吸管将需要观察的受精卵,移入另一培养皿中,在解剖镜下,观察各发育时期的外部形 态的变化。下表为虎纹蛙正常胚胎发育时期表 虎纹蛙(虎纹蛙(Rana tigrina rugulosa)正常发育时期表)正常发育时期表发育时间由受精 时所需 的时间 (h)此时期耗 时(h)水温 ()该时期特点备注第一时期受精卵0.63h26.0动物极朝上,棕黑色;植物极 朝下,乳白色室温为 26.0第二时期2 细胞期0.63h0.13 h经裂,卵裂沟贯穿动植物极第三时期4 细胞期0.76 h0.83 h经裂,卵裂沟垂直于第一次第四时期8 细胞期1.59 h0.08 h经裂,两条卵裂沟第五时期16 细胞期1.6
5、7 h0.35 h纬裂,动物半球略小于植物半 球第六时期32 细胞期2.02 h0.15 h经裂第七时期囊胚早期2.17 h0.53 h动物半球卵裂速度大于植物半 球,卵裂不同不同规则第八时期囊胚中期 2.70 h0.8 h动物极隆起第九时期囊胚晚期3.5 h1.58 h细胞边界不明显第十时期原肠胚早 期5.08 h 0.97 h赤道板上方,偏向动物极的地 方,部分细胞内陷及卷入第十一时期原肠胚中 期6.05 h2.05 h下包卵黄达 2/3第十二时期原肠胚晚 期8.1 h卵黄栓出现第十三时期神经板期1.83 h30.7胚孔封闭,胚体纵轴开始伸长, 背部变平坦此时观察地点转移到宿舍, 室温为
6、30.7,错过神经 板期第十四时期神经褶期9.93 h神经板从前端两侧开始隆起并 向后延伸形成神经褶,中间凹 陷形成神经沟第十五时期纤毛出现 期(胚胎的 转动)2.1 h30.5两侧神经褶逐渐向中间合拢, 神经沟变深而窄,然后成线状 裂缝纤毛出现期较难判断,故 错过第十六时期神经管期12.03 h0.83 h29.6神经褶完全愈合形成神经管第十七时期尾芽期12.86 h尾芽明显翘起并伸长第十八时期肌肉效应 期胚体受机械刺激,躯干及尾会 左右扭动第十九时期孵化第二十时期心跳期11.3 h28.9咽部腹面可见心脏微微搏动这段时期由于发生在深夜, 故错过,孵化指幼体出膜, 在下面发育个时期中无图 片
7、第二十一时期鳃血循环 期24.16 h4.3 h28.2鳃丝内见血球作间歇性脉冲流 动,口窝加深第二十二时期开口期28.46 h1.35 h30.0口窝内的口板膜穿通,口呈裂 缝状第二十三时期尾血循环 期29.81 h10.1 h30.1尾部与腹部交界之处可见到微 弱的血液循环第二十四时期鳃盖褶初 期39.91 h9.9 h30.8每侧外鳃基部出现皮肤褶,并 逐渐向腹面会合形成一条完整 的肤褶第二十五时期右鳃盖闭 合期49.81 h11.7 h29.8右侧外鳃丝逐渐缩短,直至被 鳃盖褶所遮盖,左侧鳃丝仍大 部分暴露第二十六时期鳃盖封闭 期61.51 h30.9左侧外鳃完全被鳃盖褶所封盖从受精卵
8、到鳃盖封闭期总共耗时从受精卵到鳃盖封闭期总共耗时 61.51h。五、虎纹蛙胚胎发育各时期五、虎纹蛙胚胎发育各时期1.受精卵;2.二细胞期;3.四细胞期;4.八细胞期;5.十六细胞期;6.三十二细胞期;7.囊胚早期;8.囊胚中期;9.囊胚晚期;10.原肠胚早期;11.原肠胚中期;12.原肠胚晚期;13.神经板期;14.神经褶期;15.纤毛出现期(胚胎的转动);16.神经管期;17.尾芽期;18.肌肉效应期;19.心跳期;20.鳃血循环期;21.开口期;22.尾血循环期;23.鳃盖褶初期;24.右鳃盖闭合期 25.角质颌期;26.鳃盖封闭期 六、讨论:六、讨论: 1.在给亲蛙注射催产时,可采用皮下注射法。具体操作是:两人配合,一人抓住青蛙, 另一人抓起蛙背部尾椎骨两侧的皮肤,将针头插进皮下,用手指按住注射口,打完后轻轻 将催产素推开,以防从伤口溢出。 2.由于整个实验过程中分在两个地方进行,在实验室维持在水温 26.0,而在宿舍则 处于 2931的波动范围内,整个实验从受精卵发育到鳃盖封闭期共耗时 61.51 小时,对照刘丽的泰国虎纹蛙与中国虎纹蛙早期胚胎发育比较研究(1)的时间为泰国虎纹蛙发育时间总计 70.4 小时,中国虎纹蛙时间总计 92.5 小时(水温(251) ,而本次实验材料为中 国虎纹蛙,证明较高温度能加快虎纹蛙胚胎发育的速度。