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1、分子生物学分子生物学实验报实验报告告实验二 从 cDNA 文库中靶片断扩增（4h）一、实验目的 1.掌握聚合酶链式反应的原理。 2. 掌握移液枪和 PCR 仪的基本操作技术。二、实验原理：PCR 技术，即聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。经典的 PCR 过程包括：变性（denaturing step）、退火（annealing step）和延伸（extension step）三个步骤。变性过程，即在高温 9498下，模板 DNA双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之形成两条单链 ssDNA。随后，模板 DNA 与引物的退火(复性)过程中，
2、温度降至 55左右，特异序列的引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；之后，引物的延伸过程，DNA 模板-引物结合物在耐热的 DNA 聚合酶（如：Taq 酶）的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24 分钟， 23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR 反应的成分和作用：总体积：一般为 25l100 l （一）无 Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris 组成。Tris
3、 用于调节反应体系 pH 值，使 Taq 酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl 可降低退火温度，但不能超过 50 mmol/L，否则会抑制 DNA 聚合酶活性。（二）Mg2+:终浓度为 1.52.0mmol/L，其对应 dNTP 为 200 mol/L，注意 Mg2+与 dNTPs 之间的浓度关系，由于 dNTP 与 Taq 酶竟争 Mg2+，当 dNTP 浓度达到 1 mmol/L 时会抑制 Taq 酶的活性。 Mg2+能影响反应的特异性和产率。 （三）BSA：一般用乙酰化的 BSA，起着减少 PCR 管对 Taq 酶的吸附作用，对 Taq 酶有保护作用。（四）底物（dNTPs）：dNTPs 具
4、有较强酸性，其储存液用 NaOH 调 pH 值至 7.07.5，一般存储浓度为10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为 20200mol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。（五）Taq 酶：能耐 95高温而不失活，其最适 pH 值为 8.38.5，最适温度为 7580，一般用 72。能催化以 DNA 单链为模板，以碱基互补原则为基础，按 53方向逐个将 dNTP 分子连接到引物的 3端，合成一条与模板 DNA 互补的新的 DNA 子链。无 35的外切酶活性，没有校正功能。某种 dNTP 或 Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用
5、量一般为 0.55 个单位/100l。（六）模板：PCR 对模板 DNA 的纯度不要求很高，但应尽量不含有对 PCR 反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA 聚合酶抑制剂、能与 DNA 结合的蛋白质。模板 DNA 的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。（七）引物：引物浓度一般为 0.10.5mol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般 1530 个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其 3末端一定要与模板DNA 配对，末位碱基最好选用 A、C、G（因 T 错配也能引发 链的延伸）。 引物 G+C 约占 455
6、5%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。PCR 反应条件的选择（影响因素）：1、温度参数：（1）变性：模板变性完全与否是 PCR 成功的关键，一般先于 94（或 95）变性 310min，接着 94变性 3060s。（2）退火：退火温度一般低于引物本身变性温度 5。引物长度在 1525bp 可通过公 Tm=(G+C)4+(A+T)2计算退火温度，一般退火温度在 4060之间，时间为 3045s。如果(G+C)低于 50%，退火温度应低于 55。较高的退火温度可提高反应的特异性。3、延伸：延伸温度应在 Taq 酶的最适温度范围之内，一
7、般在 7075。延伸时间要根据 DNA 聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于 1kb 以内的片段 1min 是够用的。循环数：PCR 的循环数主要由模板 DNA 的量决定，一般 2030 次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。PCR 产物积累规律：反应初期产物以 2n 呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA 聚合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需 PCR 循环数与模板量、PCR 扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。PCR 常见问题一.没有扩增产物1.循环温度：变性
8、温度、退火温度2.引物设计3.DNA 聚合酶活性4.抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合 酶活性的成份)5、DNA 样品二.非特异产物及电泳呈涂布状1.Mg2+浓度2.调整引物、模板、聚合酶的用量3.适当减少循环数4.适当提高退火温度，缩短退火或延伸时间三.引物二聚体的形成1.检查引物的序列2.提高退火温度3.调整引物与模板浓度4.增加引物长度四.假阳性结果的预防实验原理聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）即 PCR 技术是美国 Cetus 公司人类遗传研究所的科学家K.B.Mullis 于 1983 年发明的一种体外扩增特定基因或 DNA 序列的方法。PC
9、R 具有很高的特异性、灵敏度，在分子生物学、基因工程研究、某些疾病的诊断以及临床标本中病原体检测等方面具有极为重要的应用价值。双链 DNA 分子在接近沸点的温度下解链，形成两条单链 DNA 分子（变性），与待扩增片段两端互补的寡核苷酸（引物）分别与两条单链 DNA 分子两侧的序列特异性结合（退火、复性），在适宜的条件下，DNA 聚合聚利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷酸（dNTP），在引物的引导下，按 5-3的方向合成互补链，即引物的延伸。这种热变性、复性、延伸的过程就是一个 PCR 循环。随着循环的进行，前一个循环的产物又可以作为下一个循环的模板，使产物的数量按 2n 方式增长。从理论上讲，
10、经过 25-30 个循环后 DNA 可扩增 106-109 倍。除上述典型的 PCR 反应外，人们还根据各种用途设计了各种不同类型的特殊 PCR。如利用反转录PCR（RT-PCR），即利用组织 mRNA 进行反转录后合成第一链 cDNA，以此为模板经 PCR 合成特定目的基因；反向 PCR，常规 PCR 允许扩增两条引物之间的 DNA 片段，而反向 PCR 则可以对靶 DNA 区域之外的两侧未知的 DNA 序列进行扩增；不对称 PCR 使用的引物浓度不同，两种引物浓度相差 100 倍，在最初的 20个循环中主要产物是双链 DNA，当低浓度引物被消耗后，高浓度引物引导的 PCR 反应产生大量单链
11、 DNA分子，可用于 DNA 的序列测定；在 PCR-ELISA 中，将引物用地高辛、生物素或放射性同位素标记，再进行PCR 扩增，用 ELISA 方法检测反应产物的灵敏度可提高百倍以上；采用定量 PCR，即用荧光物质标记引物，根据反应进程中荧光变化情况，可以确定组织中 mRNA 含量，从而了解不同生长发育时期组织特定基因的表达水平等。影响 PCR 反应结果的因素较多，主要包括（1）模板的质量：在制备模板 DNA 时通常需要使用蛋白变性剂及乙醇等有机溶剂，这些物质可直接影响 PCR 反应；另外当模板 DNA 分子量很高时，解链不易，可用限制酶消化以改善扩增效果；从理论上说，一个模板 DNA 分
12、子即可获得扩增产物，模板浓度过高，PCR 反应的特异性下降，实际操作中可按1ng、0.1ng、0.01ng 递减的方式设置模板浓度对照。（2）引物：引物是决定 PCR 结果的关键，引物设计在 PCR 反应中极为重要。要保证 PCR 反应能准确、特异、有效地对模板 DNA 进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：引物的长度以 15-30bp 为宜，一般（G+C）的含量在 45-55%，Tm 值高于 55Tm=4(G+C)+2(A+T)。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。引物的 3端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在 3端不应出现同源性，以免
13、形成引物二聚体。3端末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5 个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过 3 个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。人工合成的寡聚核苷酸引物需经 PAGE 或离子交换 HPLC 进行纯化。引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用 0.25-0.5pmoL/L 较好。（3）Mg2+浓度：PCR 反应体系中 Mg2+浓度对扩增结
14、果影响较大，通常是 1.5-4mmoL/L，必要时可调整Mg2+浓度。（4）dNTP 浓度：1.25mmol/L，dNTP 浓度过高，反应的特异性下降。（5）反应条件：PCR 反应条件中最重要的是退火温度，退火温度低，引物容易结合到模板的靶 DNA 序列，但反应的特异性下降；反之，特异性增加，但扩增效果不佳。一些生物技术公司在合成引物时注明了 Tm 值，以此为依据，退火温度比 Tm 值低 3-5比较适宜。当然，在实际操作时可设置梯度以确定最佳退火温度。实验目的了解聚合酶链反应（PCR）的基本原理及其影响因素，掌握 PCR 的基本操作过程。仪仪器器PCR 仪、台式离心机、电泳仪、电泳槽、紫外检测
15、仪试剂试剂1、引物：用去离子水配成 10 mol /L。 2、Taq 聚合酶3、10PCR 反应缓冲液（加镁离子）4、dNTPs：四种核苷酸混合物，浓度为 10mM5、模板：含有 R 基因片段的重组 cDNA 的质粒6、1%琼脂糖凝胶7、50 TAE 电泳缓冲液(1000 mL)Tris 242 g，Na2EDTA.2H2O 37.2 g， 溶于 600 ml 去离子水中；加冰乙酸 57.1 ml, 最后用去离子水定容至 1000 mL。 8、6 上样缓冲液0.25% 溴酚蓝；0.25%二甲苯睛蓝，30%甘油，溶于水中，4保存。【实验内容】1、引物设计 2、PCR 3、琼脂糖凝胶电泳4、PCR
16、 片断的验证实验实验步步骤骤1、反、反应应混合液的配制：混合液的配制：在一个 0.5mlPCR 管中加入下列成分：正反两种引物 F/R各 2l10PCR 缓冲液10ldNTPs2lDNA 模板1lTaq 酶0.5lddH2O补至 20l补至 50l充分混匀，离心片刻，使液体沉至管底。 实际操作时，先根据所需进行的反应数，配制反应混合物（按上述配方，不含模板）。每组进行 3 个反应，需配制 76 微升反应混合物，则按上述配方的 4 倍进行配制。然后分装于 4 个 PCR 管中，每管 19 微升。其中 3 管每管加入 1 微升模板，另一管加入 1 微升水，作为对照。2、 、PCR 反反应应条件条件循环 1：94，3 分钟；循环 2-31：94变性 45s、52退火 45s、72延伸 1min；共 30 个循环；最后72延伸 10 分钟。3、反应结束后，取 5 微升反
