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1、 华中科技大学生命科学与技术学院生物化学实验教案-1-华中科技大学生命科学与技术学院2010实验一 3 , 5 -二硝基水杨酸比色法测量面粉中还原糖和总糖的含量一、实验目的通过本实验, 掌握还原糖定量测定的基本原理, 练习比色法测定糖的基本操作, 熟悉分光光度计的使用方法. 二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法. 还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类, 单糖都是还原糖, 双糖和多糖不一定是还原糖, 其中乳糖和麦芽糖是还原糖, 蔗糖和淀粉是非还原糖. 利用糖的溶解度不同, 可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来, 对没有还原性的双糖和多糖, 可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行
2、测定, 再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计). 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物, 3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸. 在一定范围内, 还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系, 利用分光光度计, 在 540nm 波长下测定光密度值, 查对标准曲线并计算, 便可求出样品中还原糖和总糖的含量. 由于多糖水解为单糖时, 每断裂一个糖苷键需加入一分子水, 所以在计算多糖含量时应乘以 0.9. 三、实验试剂及仪器【实验器材实验器材】具塞玻璃刻度试管：20mL11、塑料离心管 10mL x 6、烧杯：100mL1、锥形瓶：100mL1、
3、容量瓶：100mL3、吸量管：1mL1 2mL2 10mL1、恒温水浴锅、离心机、电子天平、分光光度计、玻璃棒、胶头滴管、白瓷板、旋涡混合仪【试剂试剂】面粉、1mg/mL 葡萄糖标准液、3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂、碘-碘化钾溶液、酚酞指示剂、6mol/L HCl 、6mol/L NaOH. 四、操作步骤华中科技大学生命科学与技术学院生物化学实验教案-2-华中科技大学生命科学与技术学院20101. 样品中还原糖和总糖的提取样品中还原糖和总糖的提取(1)还原糖的提取准确称取 3.00g 食用面粉, 放入 100mL 烧杯中, 先用少量蒸馏水调成糊状, 然后加入 50mL 蒸 馏水, 搅匀,
4、 置于 50恒温水浴中保温 20min, 使还原糖浸出. 将浸出液(含沉淀)转移到塑料离心管 中, 调至 4 000r/min 下离心 5min, 沉淀可用适量蒸馏水洗一次, 再离心, 将两次离心的上清液收集 在 100mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度, 混匀, 作为还原糖待测液. (2)总糖的水解和提取准确称取 1.00g 食用面粉, 放入 100mL 锥形瓶中, 加 15mL 蒸馏水及 10mL 6mol/L HCl, 置 沸水浴中加热水解 30min(水解是否完全可用碘-碘化钾溶液在白瓷板上进行检查). 待锥形瓶中的水解 液冷却后, 加入 1 滴酚酞指示剂, 用 6mol/LNaOH
5、 中和至微红色, 用蒸馏水定容在 100mL 容量瓶中, 混匀. 取溶液 10mL, 移入另一 100mL 容量瓶中定容, 混匀, 作为总糖待测液. 2. 显色和比色显色和比色取 11 支 20mL 具塞刻度试管, 编号, 按下表所示分别加入相应试剂. 并将其在涡旋震荡器上进行 混匀. 管号标准葡萄糖溶 液/ml还原糖待 测液/ml总糖待测 液/ml蒸馏水/mlDNS /ml吸光度002.01.510.21.81.520.41.61.530.61.41.540.81.21.551.01.01.561.20.81.570.51.51.580.51.51.591.01.01.5101.01.01.
6、5将上述试管放在沸水浴中加热 5min 进行显色, 取出后用流动水迅速冷却, 各加入蒸馏水, 定容成20ml, 摇匀, 放置 20min. 在 540nm 波长处测定光吸收值. 取 0 到 6 号试管的吸光度, 以葡萄糖含量(mg/mL)为横坐标, 光吸收值为纵坐标, 在坐标纸上绘制标准曲线. 3. 结果与计算：结果与计算：华中科技大学生命科学与技术学院生物化学实验教案-3-华中科技大学生命科学与技术学院2010计算出 7、8 号管光密度值的平均值和 9、10 管光密度值的平均值, 在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数, 按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量. 还原糖(%)=查曲线所得葡
7、萄糖毫克数 提取液总体积 测定时取用体积 样品毫克数 100总糖(%)=0.9100查曲线所得水解后还原糖毫克数 稀释倍数 样品毫克数注：1 离心时对称位置的离心管必须配平. 2. 放取水浴后的烧杯, 锥形瓶, 试管时, 为防止被烫伤, 应使用试管夹. 3. 验证淀粉是否水解完全时, 所取的碘碘化钾溶液不要过多, 否则反应后的颜色会被碘碘化钾溶液的颜色所覆盖. 分光光度计的使用方法：分光光度计的使用方法：1 开机 ：打开仪器电源开关, 调至所需波长, 定位于 A 挡, 预热 20 分钟. 2 向比色皿内注入少量试液, 润洗三次, 然后注入 3/4 至 4/5 的试液, 用擦镜纸擦干外壁所挂水珠
8、. 将比色皿顺序放入样品池. (注意拿比色皿的时候拿毛玻璃面并垂直放入)3 在样品池中放置空白液与样品.4 将空白液对准通光孔, 按“100%T/OA”, 待其显示“.000”即可. 然后将手柄拉出半格, 按“ 0%T”, 待显示屏显示“1.-”即可.5 拉动手柄, 将样品置入光路, 从显示屏上读取吸光度.华中科技大学生命科学与技术学院生物化学实验教案-4-华中科技大学生命科学与技术学院2010实验二 蛋白质及氨基酸的呈色反应 实验目的1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 （一）双缩脲反应（一
9、）双缩脲反应实验原理1尿素加热至 180左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与 cu2+结 合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似， 也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 2一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋 白质或多肽。【实验器材及试剂】器材：器材： 试管、酒精灯、试管夹、试管架 试剂：试剂： （1）尿素 （2）10%氢氧化钠溶液 （3）1%硫酸铜溶液 （4）2卵清蛋白溶液【实验步骤】华中科技大学生命科学与技术学院生物化学实验教案-5-华中科技大学生命科学与技术学院2010取少量尿素结晶
10、，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时， 停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加 10氢氧化钠溶液 1 毫升，振荡混匀， 再加 1硫酸铜溶液 1 滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，否 则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 向另一试管加卵清蛋白溶液 l 毫升和 10氢氧化钠溶液 2 毫升，摇匀，再加 1硫酸 铜溶液 2 滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。（二）茚三酮反应（二）茚三酮反应【实验原理】除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有 氨基酸及一切蛋白质都能 和茚三酮反应生成蓝紫色物质。 该反应十分灵敏，1：1 500 000 浓度的氨基酸水
11、溶液即能给出反应，是一种常用的氨基 酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成 CO2、NH3 和醛，水合茚三酮被还原 成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生 成有色物质。 反应机理如下： 华中科技大学生命科学与技术学院生物化学实验教案-6-华中科技大学生命科学与技术学院2010【实验器材及试剂】器材：器材： 试管、酒精灯、试管夹、试管架 试剂：试剂： (1) 蛋白质溶液：2卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清：水1：9) (2) 0.5甘氨酸溶液 (3) 0.1茚三酮水溶液 (4) 0.1茚三酮乙醇溶液【实验步骤】(1) 取 2 支试管分别
12、加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液 1 毫升，再各加 0.5 毫升 0.1茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热 12 分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。(2) 在一小块滤纸上滴一滴 0.5的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴 0.1的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。（三）黄色反应（三）黄色反应【实验原理】含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合 物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应式如下：【实验器材及试剂】器材：器材： 试管、酒精灯、试管夹、试管架 试剂：试剂： (1) 鸡蛋清溶液 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按 1：20 混匀，然后用六层纱
13、布过滤。 (2) 大豆提取液 将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状用纱布过滤。 (3 ) 头发 (4) 指甲 (5) 0.5苯酚溶液 (6) 浓硝酸 华中科技大学生命科学与技术学院生物化学实验教案-7-华中科技大学生命科学与技术学院2010(7) 0.3色氨酸溶液 (8) 10氢氧化钠溶液 【实验步骤】向 6 个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微 火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入 10氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。 管号管号123456 材材 料料鸡蛋清溶鸡蛋清溶 液（液（4 滴）滴）大豆提取大豆提取 液（液（4 滴）滴）指甲屑指甲屑 （少许）（
14、少许）头发（少头发（少 许）许）0.5%苯酚苯酚 （4 滴）滴）0.3%色氨酸色氨酸 （4 滴）滴）浓硝酸浓硝酸2 滴滴4 滴滴2mL2mL4 滴滴4 滴滴 现象现象思考题1. 通过本次试验，你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？它们的原理？2. 从本次实验的每个实验中，应该注意的事项都有哪些？华中科技大学生命科学与技术学院生物化学实验教案-8-华中科技大学生命科学与技术学院2010实验三 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳一、实验目的1.掌握醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作过程; 2.熟悉人血清中各主要蛋白质的相对百分含量及其测定方法. 二、实验原理电泳是指带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极
15、移动的现象. 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术. 本实验以醋酸纤维薄膜为支持物, 分离血清中的主要蛋白：清蛋白、1、 2、 、 球蛋白. 蛋白质是典型的两性物质, 而这五种蛋白的pI1 巴比妥-巴比妥钠缓冲液( pH 8.6, 离子强度 0.06):华中科技大学生命科学与技术学院生物化学实验教案-9-华中科技大学生命科学与技术学院2010称取巴比妥 1.66g 和巴比妥钠 12.76g, 用蒸馏水约 250ml 加热溶解并定容到 1000mL. 染色液:称取氨基黑 10B 0.5g, 加入蒸馏水 40mL, 甲醇 50mL 和冰醋酸 10mL. 混匀后储存于试剂瓶中备用. 漂洗
16、液:量取 95%乙醇 45mL, 冰醋酸 5mL 和蒸馏水 50mL 混匀, 储存于试剂瓶中备用. 【材料材料】血清(未溶血)四、操作步骤1薄膜的准备及筛选薄膜的准备及筛选将醋酸纤维薄膜置于洁净滤纸上2, 在无光泽面距一端 1.5cm 处用铅笔做上标记. 将薄膜无光泽面朝下完全浸泡在巴比妥缓冲液中 15-20min. 浸泡过程中筛选3 合适的薄膜. 2安装电泳槽安装电泳槽将洁净的电泳槽置于操作台上, 调节底部旋钮使其水平, 接好冷却水装置, 将裁好的滤纸(或纱布)折为4 层, 作为滤纸桥. 向电泳槽中注入巴比妥缓冲液至电泳槽上标注的红线处, 保持槽中液面等高. (图 1-2)图 3-2 电泳装置示意图3点样点样将浸泡的薄膜取出, 用滤纸吸去多余水分. 将血清样品涂在玻片末端4, 然后轻按在薄膜无光泽面做标记处5(图 1-3), 待血清渗入薄膜
