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1、一、一、食品中兽药残留的检测技术食品中兽药残留的检测技术 我国食品安全检测主要应用技术的研究及现状我国食品安全检测主要应用技术的研究及现状 食品工业科技VOL24，（12），2003张志洁 林清玉 现状分析随着集约化畜牧业的发展，兽药的作用范围也在扩大，有的药物如抗生素、磺胺药、激素等已广泛用于促进畜禽的生长、减少发病率和提高饲料利用率、促进同期发情。在饲料添加剂中，抗生素用量占有相当大的比重。兽药的广泛应用使畜牧业在增产的同时，也带来了兽药残留的问题。八十年代，欧美等国已开始建立了兽药残留检测体系，并制定了较为完善的兽药用量、休药期及有关法律法规。我国兽药残留检测体系尚不够完备，时常发生因畜
2、产品中药物残留超标而被外国拒绝进口的事件，给我国农产品出口造成很大的经济损失。“十五”期间，我国将重点加强兽药监察体系和兽药残留检测体系的建设。农业部每年投入1755 万元用于兽药残留监控，发展了近75 种单个兽药在饲料监控和动物源食品中残留的测定方法。国家质检总局每年也投入大量资金，针对出口和欧盟监控的需要，建立一些兽药残留的检测方法。但对于某些禁用兽药（主要是“)兴奋剂和激素），其分析方法的灵敏度尚不能满足需要，或大量监控的成本难以承受。克伦特罗（瘦肉精）的检测方法克伦特罗（瘦肉精）的检测方法欧盟和美国FDA立法禁止克伦特罗在肉用畜禽中的使用;规定牛和马肝中的最大残留限量必须小于0.5g/
3、kg。我国2001年也实施了鲜冻禽产品不准检出克伦特罗的标准。对于克伦特罗，农业部已经颁布了采用高效液相色谱筛选和气)质联机验证的饲料测定方法（NY428-2001），但未使用国际认可的确证方法（稳定性同位素稀释技术）。卫生部组织了肉中克伦特罗中毒控制 方法的探索研究，营养与食品安全所和北京市疾病控制中心分别建立了HPLC-紫外与电化 学检测方法和GC-MS 方法， 正在探索HPLC-MS/MS串联检测方法。营养与食品安全所、 南京农大、华中农大和河南农科院均进行了ELISA试剂盒国产化的研究。但是，用HPLC或 GC-MS 检测克伦特罗处理步骤复杂，费用昂贵，制约了其大量推广使用。在国内，河
4、南 农业科学院生物技术研究所与河南百奥生物工程有限公司应用单克隆抗体，研制出具有自 主知识产权的盐酸克伦特罗快速检测试剂盒和试纸条，已在全国推广应用。上海赛群生物 科技有限公司、上海复博软件科技有限公司均有克伦特罗酶免疫检测试剂盒出售。国内流 通的进口产品有德国拜发公司的R-BIOPHARM 及英国RANDOX公司的ELISA检测试剂盒。氯霉素的检测方法氯霉素的检测方法 测定氯霉素可以用生化方法，但这些方法的灵敏度偏低 0.5-1g/kg） ，大多情况下主要 采用 GC 和 HPLC 及色质联用的方法，也有薄层色谱法的报道，但过程繁琐，显色复杂。 美国食品药物管理局 FDA 最近通报了美方现行
5、的氯霉素检测方法：用 CHARM-II 方法筛 选，用 LC-MS 方法进行确认，检测限量由原来的 5g/kg 降为现在的 1g/kg，再降为0.3g/kg，且 FDA 正在研究应用更敏感的方法，可使检测限达到 0.1g/kg。国内正在加紧 对氯霉素快速检测的研究开发，如华中农大的石德时等建立了氯霉素的间接竞争 ELISA 法，湖南长沙的福科特生物化学有限公司已经在出售氯霉素免疫检测试剂盒。兽药残留引起的食品污染不仅与公众的健康密切相关,而且直接影响产业界的经济利益 和国际贸易,已成为公认的农业和环境问题。20 世纪 70 年代以来,畜牧业生产中抗生素、 抗菌素、生长促进剂的广泛使用,食品中药
6、残的问题已经相当普遍。尽管残留的水平通常很低,发生急性中毒的可能性极小,但这种长期、低水平的接触方式产生的各种慢性、蓄积毒性,如 三致(致癌、致畸、致突变) 、免疫毒性、发育毒性和 生态毒性等对健康和环境产生 的危害是肯定的2 - 4 。滥用兽药、不遵守休药期、非法使用违禁药物导致食品中药物残 留超标的现象常有存在,兽药残留引起的食品安全问题令人担忧。 由于药物添加剂对畜牧业生产的重要价值,近年来的使用仍呈上升势头,取消全部药物添 加剂的使用已不现实,因此,各国政府和国际组织十分重视对兽药残留实施愈来愈严格的计划 监控5 。 药物残留分析是实施药残监控的基本手段,20 世纪 80 年代以来发展
7、迅速,成为农业化 学、分析化学中最活跃的研究方向之一。与药品分析不同,药残分析的特殊性和复杂性在于 待测物的痕量、动态、浓度波动范围大, 在于样品基质复杂、干扰物质多,在于样品基质和 待测组分的不确定性等,要求分析技术具有灵敏度高、选择性或分离能力强和线性范围宽等 特点,传统意义上的化学分析方法通常不能独立进行。待测物的样品前处理和检测是药物残 留分析的两个基本主题,现阶段,色谱、质谱、电泳、免疫分析及联用技术不断优化和日趋完 善,药残的检测工作逐渐简化,而样品的前处理越来越成为兽药残留分析过程中的关键。 因兽药残留的痕量及生物样品的复杂性,将药残从生物流体或生物基质中释放出来、除 去其中的干
8、扰杂质并达到仪器可检测的浓度范围是一件麻烦的事。样品的前处理过程涉及 的因素很多,直接影响各项分析指标、成本和效率,占用 70 % 以上的分析工作量。近十几年 来,兽药的种类和应用规模剧增,化学结构组成日益复杂,并日趋高效或低剂量化,特别是人们 对长期摄入低水平兽药残留所致的各种慢性及远期效应的关注和国际间贸易等原因,使分析 对象、样本数量和测定难度大大增加,经典的样品前处理方法通常繁琐复杂、操作 时间长、选择性差,逐渐满足不了兽药残留分析的发展要求,一些新的样品前处理技术被 应用到这个领域。 1 固相萃取(SPE) 固相萃取(Solid Phase Extraction , SPE) 是利用
9、固体吸附剂将液体样品中的目标化合物 吸附,与样品的基体和干扰化合物分离,然后再用洗脱液洗脱达到分离和富集目标化合物的目 的。SPE 的净化机制和淋洗操作与传统的开放式柱色谱方法之间不存在原则上的区别,但 SPE 常指使用预制的装有各种色谱填充料的可弃小柱。与液- 液萃取相比固相萃取有很多 优点:固相萃取不需要大量互不相溶的溶剂,处理过程中不会产生乳化现象,它采用高效、高 选择性的吸附剂(固定相),可以净化很小体积的样品(50 - 100l) ,能显著减少溶剂的用量,简化 样品于处理过程,同时所需费用也有所减少。固相萃取实质上是一种液相色谱分离,其主要分 离模式可分为正相、(吸附剂极性大于洗脱液
10、极性) ,反相(吸附剂极性小于洗脱液极性) ,离子 交换和吸附。固相萃取所用的吸附剂也和 HPLC 常用的固定相相同,大多为高聚物,分离效 率高,处理样品的比容量大,只是在粒度上有所区别,固相萃取柱上所加压一般都不大,分离目 的只是把目标化合物与干扰化合物和基体分开即可,柱效要求一般不高,仅为 10 - 50 塔板/ m2 ,故作为固相萃取吸附剂的填料都较粗,一般在 40m 即可用,粒径分布要求也不严格,这 样可以大大降低固相萃取柱的成本,易操作,并且一次性使用。除了各种规格和型号的固相萃 取小柱已商品化之外,有多种固相萃取的专用装置出售,使固相萃取使用起来更加方便简单, 实现净化过程的自动化
11、。 SPE 既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的提取、又可用于净化、浓缩或富集, 是目前兽药残留分析样品前处理中的主流技术。磺胺类药物( sulfonamides , Sas) 是畜牧业 中常用的广谱抗菌素,采用液- 液萃取的方法处理样品,检测结果背景干扰大、低浓度下回收 率低,容易产生误判。刘海新6 以 HPLC 检测罗非鱼肌肉中磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethazine) ,其 样品前处理采用 ODS - C18(200mg) 柱固相萃取,该方法的精密度和准确度都比现有的标准 方法 SN0208 - 93 出口肉中 10 种磺胺残留量的检测方法高,在 0. 01mg/ kg 的浓度下
12、,回收率可达到 80 %以上,相对标准偏差为 2. 83 %;李俊锁等7 采用 Sep -Pak 碱性氧化铝 SPE 用 于肝组织中 7 种磺胺药物的净化:样品经乙腈提取、正已烷萃取和氧化铝柱 SPE 净化后测 定,净化效 果显著,回收率 68. 8 % - 100. 0 % ,检出限低于 0. 05mg/ kg。对于复杂样品净化,组合 SPE 方式(样品经过二个 SPE 柱) 通常很有效果。检测蜂蜜样品中的四环素(tetracyclines , TCs) 残留,样品经 C18 柱净化后尚不能满足 HPLC 的检测要求,背景干扰峰影响了结果的定 性定量,Oka8 等采用双柱 SPE 净化形式,
13、 蜂蜜样品用 EDTA 缓冲液提取后,先过 Baker10 C18 柱, 再经 Baker10 - COOH(阳离子 交换柱) 进一步净化,这种前处理方法所得结果的回收率、精密度都能满足 HPLC 分析要求。 在多残留组分分析中,更简便的方法是采用混合型固定相(mixed -phase) SPE ,可以使用混合 键合相硅胶(通常具有疏水和离子交换两种基团) ,或将两种填料混合装柱,分离机制取决于 pH 和淋洗溶剂。苯乙胺(phenethylamines ,PEAs) 是一组药理效应上属于拟肾上腺素的药物,典 型的药物如克仑特罗(clenbuterol),其结构中均含有疏水的饱和烃链和含氮碱性中
14、心,分苯酚 型和苯胺型两大类,理化性质差异较大,用单一 SPE 净化样品回收率较低,净化效果不理想, Gabiola9 等建立用混合固定相 SPE 柱(Bod - Elut Certify) 净化牛尿样中的克仑特罗、沙 丁胺醇、特布他林及它们的轭合残留物的方法,先将样品调至中性 pH ,样品通过 SPE 柱, PEAs 被反相机制保留,将 SPE 柱用 1.0mol/ L 乙酸酸化,质子化的药物与固定相中的磺酸基 ( - SO-3 )结合,有机溶剂洗涤除去杂质,用含 2 %氨水的乙酸乙酯洗脱药物。 2 基质固相分散技术(MSPD) 基质固相分散(Matrix solid - phase dis
15、persion , MSPD) 是 Barker 等10 在 1989 年提出 并给予理论解释的一种快速样品处理技术。其基本操作是将样品(固态或液态) 直接与适量 反相键合硅胶一起混合研磨,使样品均匀分散于固定相颗粒的表面,制成半固态装柱,然后采 用类似于 SPE 的操作进行洗脱。所用的填充料一般为 C18 或 C8 ,样品和填充料的比例通 常为 1 :4。MSPD 是一种在 SPE 的基础上改进后的样品处理方法,较 SPE ,它的优点在于:它 依靠机械剪切力、C18 键合相的去垢效应和巨大的表面积使样品结构破碎并且在填料表面 均匀分散,浓缩了传统的样品前处理中所需的样品匀化、组织细胞裂解、提
16、取、净化等过程, 避免了样品匀化、转溶、乳化、浓缩造成的待测物损失,而且固定相处理样品的比容量大,提 取净化的效率较高。 MSPD 处理样品耗时短、节省溶剂、样品用量少,引起兽药残留分析界的广泛关注,在 Barker 等10 提出 MSPD ,成功地应用于分析牛肉中的苄青霉素、氨苄青霉素和头孢匹林 后的数年间,该方法已被用于近 40 种的兽药残留分析1 。Schenck 采用 MSPD 和碱性氧 化铝 SPE 柱净化牛肝组织中的伊维菌素(ivermectin , IVR) ,将 2g C18 填料(40 - 60 目) 与 0. 5g 组织混合,研磨成均质的半固态,装柱,正已烷洗涤,二氯甲烷- 乙酸乙酯(3 + 1) 洗脱,流出 液经氧化铝柱,浓缩后进行荧光衍生化 HPLC/ FLD 测定, 平均回收率 75 % , 检测限为 0. 001mg/ kg ;Boyd12 - 13 等报道了肝组织中的克仑特罗的 MSPD 净化法,将 0. 5g 组织与 2gC18 填料在研钵中混合,研磨 30 - 40s
