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1、石蜡切片免疫组化二步法操作规程石蜡切片免疫组化二步法操作规程基于 DAKO Real Envision Detection Kit1.65烤箱中烤片 30min；2.二甲苯脱蜡（共四缸，第一缸 10min，后三缸涮过） ；3.梯度酒精脱苯（100%两缸，90%、80%、70%各一缸，依次涮过） ；4.自来水振洗；5.去离子水浸洗 1 次；6.抗原修复；7.PBS 振洗三次；8.3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育 30min；9.PBS 振洗三次；10.一抗 4孵育过夜；11.PBS 振洗三次；12.滴加二抗聚合物，室温孵育 30min；13.PBS 振洗三次；14.滴加 DAB，显微镜下控制显色，
2、去离子水终止显色，记录显色时间；15.自来水冲洗一次；16.苏木素复染 30sec；17.自来水清洗一次；18.盐酸酒精分化 5sec；19.自来水冲洗 30min 返蓝；20.梯度酒精脱水（70%、80%、90%各一缸，100%两缸，依次涮过） ；21.二甲苯脱水（共三缸，前两缸涮过，第三缸 5min） ；22.中性树胶封片。石蜡切片免疫组化三步法操作规程石蜡切片免疫组化三步法操作规程基于 DAKO LSAB2 System-HRP Detection Kit1.65烤箱中烤片 30min；2.二甲苯脱蜡（共四缸，第一缸 10min，后三缸涮过） ；3.梯度酒精脱苯（100%两缸，90%、8
3、0%、70%各一缸，依次涮过） ；4.自来水振洗；5.去离子水浸洗 1 次；6.抗原修复；7.PBS 振洗三次；8.3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育 30min；9.PBS 振洗三次；10. 切片置于湿盒中，滴加封闭血清（白色滴瓶装）室温封闭孵育 30min；11. 甩去封闭血清（无需 PBS 清洗） ，滴加一抗 4孵育过夜；12. PBS 振洗三次；13. 滴加二抗（黄色滴瓶装） ，室温孵育 30min；14. PBS 振洗三次；15. 滴加 HRP 试剂（粉色滴瓶装） ，室温孵育 30min；16. PBS 振洗三次；17. 滴加 DAB，显微镜下控制显色，去离子水终止显色，记录显色时间；1
4、8. 自来水冲洗一次；19. 苏木素复染 30sec；20. 自来水清洗一次；21. 盐酸酒精分化 5sec；22. 自来水冲洗 30min 返蓝；23. 梯度酒精脱水（70%、80%、90%各一缸，100%两缸，依次涮过） ；24. 二甲苯脱水（共三缸，前两缸涮过，第三缸 5min） ；25. 中性树胶封片。抗原修复抗原修复（1）抗原修复液：1）pH6.0 柠檬酸缓冲液：商品化储存液，1:100 稀释，200ml/框；2）pH8.0 Tris-EDTA 缓冲液：商品化储存液，1:50 稀释，200ml/框；3）pH9.0 Tris-EDTA 缓冲液：商品化储存液，1:50 稀释，200ml/
5、框；4）胰酶（Trypsin）修复液：商品化储存液，1:5 稀释。（2）抗原修复法1） 高压修复：电压力锅设定 121，5min，将切片置于抗原修复缓冲液中，放置于压力锅内，保持泄气阀开放；启动电压力锅，待泄气孔有大量蒸汽喷出后，关闭泄气阀；达到保温时间后电压力锅会自动停止，待温度降到 80后，开盖取出切片，室温自然放凉。2） 微波修复：抗原修复液置于塑料染色缸中，微波加热至沸腾；将切片置入染色缸中，中火加热 2 分钟，关火保持 2min，重复 3 次，室温自然放凉。3） 酶修复：切片置于湿盒中，每片滴加 100ul 胰酶修复液，37孵育 30min。2.3%过氧化氢-甲醇溶液配制：取 20m
6、l 过氧化氢原液（30%） ，加 180ml 甲醇，配制成 3%过氧化氢-甲醇溶液 200ml。3.DAB 配制：DAB 原液以稀释液按照 1:50 稀释，每片滴加 50ul。4.PBS 配制（pH7.2-7.4, 0.01M 工作液）：1） 5000ml：NaCl 42.5g, Na2HPO4.12H2O 14.5g, NaH2PO4.2H2O 1.5g，加 400ml 去离子水搅拌溶解，去离子水补足体积至 5000ml；2） 20000ml：NaCl 170g, Na2HPO4.12H2O 58g, NaH2PO4.2H2O 6g，加 400ml 去离子水搅拌溶解，去离子水补足体积至 20000ml；
