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1、本科生毕业论文（设计）本科生毕业论文（设计）题 目:淮河鲤鱼不同组织同工酶 POD、CAT、MDH、 GDH 的比较研究姓 名: 石先平 学 院: 生命科学学院 专 业:生物科学 班 级: 06 生科（2）班 学 号: 2006334220 指导教师: 肖明松 职称: 副教授 2010 年 06 月 02 日安徽科技学院教务处制目目 录录 摘要 1关键词 1引言11 材料与方法1 1.1 实验材料试剂和仪器11.1.1 实验材料1 1.1.2 主要试剂1 1.1.3 主要仪器21.2 实验方法21.2.1 酶样品的提取21.2.2 血清样品的制备3 1.2.3 储备液及其制备31.2.4 凝胶
2、的制备31.2.5 点样与电泳41.2.6 剥胶与染色41.2.7 褪色及扫描51.2.8 酶的命名52 结果与分析52.1CAT 的结果分析 52.2POD 的结果分析 52.3MDH 的结果分析 62.4GDH 的结果分析 63 讨论 7 3.1 淮河鲤鱼同工酶的表达具有明显的组织特异性 73.2 淮河鲤鱼同工酶组织特异性与功能的相关性 8 4 结论 9 5 致谢9参考文献10淮河鲤鱼不同组织同工酶淮河鲤鱼不同组织同工酶 POD、CAT、MDH、GDH 的研究比的研究比 较较 生物科学生物科学专业专业学生学生 石先平石先平 指指导导教教师师 肖明松肖明松摘要：本文运用聚丙烯酰胺垂直梯度凝胶
3、电泳方法对淮河鲤鱼11种组织（脑、心脏、肌肉、眼睛、肝脏、脾脏、血液、肾脏、精巢、肠、鳃）中的4种同工酶（POD、CAT、MDH和GDH)的表达模式、同工酶位点及其酶谱表型进行了分析。结果表明：CAT在淮河鲤鱼中共检测到4条酶带（CAT1、CAT2、CAT3 、CAT4)，其中鳃中含量最多，脑和血液中没有；POD检测到6条酶带（POD1 、POD2、POD3、POD4、POD5 、POD6)，其中血液含量最高。MDH检测到2条酶带(MDH1 、MDH2)在脑和肝中含量较多，其他都比较少。GDH检测到3条酶带（GDH1 、GDH2、GDH3)其中肝和肾脏中含量较高。淮河鲤鱼4种同工酶系统具有不同
4、程度的织特异性，且同工酶的种类与活性变化与其功能相适应。关键词：淮河鲤鱼 聚丙烯酰胺凝胶电泳 POD CAT MDH GDH引言：鲤鱼(Cyprinus carpio)隶属于辐鳍鱼亚纲的鲤形目，鲤鱼是在亚洲原产的温带性淡水鱼。喜欢生活在平原上的暖和湖泊，或水流缓慢的河川里。分布在除澳洲和南美洲外的全世界。属于底栖杂食性鱼类。属于底栖杂食性鱼类。鲤鱼具有较高的养殖价值，味美鲜嫩，在经济鱼类中占有重要的地位。淮河鲤鱼更是味美肉鲜，有很高的食用价值。为了促进淮河淡水渔业的长久发展和产量提高，极需对其种质进行研究，以保持和提高其经济性状，需进行大量的遗传背景和遗传基础调查。同工酶作为基因产物，是基因型
5、的生化表现型，是生物体生命活动中各水平上生理功能的重要参与者。因此，同工酶是分析生物的发育、遗传、系统进化和生理过程的有效探针，也是研究鱼类生化遗传的重要手段。利用同工酶电泳分析方法，分析其同工酶分布的组织特异性，以便直接利用某些基因产物作为遗传标志，对其进行种质鉴定，提供种质质量参数，对加速水产事业的科学化，进一步提高淡水养殖的经济效益具有重要意义1。1 材料与方法 11 实验材料、试剂和仪器实验材料、试剂和仪器111 实验材料实验鱼来源淮河流域蚌埠段，鱼龄 12 龄，全长 1115 cm， 体质量为 100 g200g（雄鱼 6 尾，雌鱼 4 尾） ，选用的实验鱼体均经充氧袋运回实验室，并
6、在水族箱中充气暂养备用。1.1.2 主要试剂丙烯酰胺(Acr，Solarbio)甲叉双丙烯酰胺（Amresco）三羟甲基氨基甲烷（Tris，Solarbio）过氧化氢（上海化学试剂有限公司）硫酸锰（盐城凤阳化工有限公司）盐酸（上海化学试剂有限公司）氢氧化钠（上海化学试剂有限公司）联苯胺（上海索莱宝生物科技有限公司）愈创木酚(天津市化学试剂一厂)氧化型辅酶 I(NAD，Solarbio)氯化硝基四氮唑蓝（NBT，Amresco）吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS，Sigma)溴酚蓝（上海索莱宝生物科技有限公司）三氯乙酸（上海索莱宝生物科技有限公司）硫代硫酸钠（北京百灵威科技有限公司）碘化钾（广州化学试剂厂
7、）磷酸氢二钠（国药集团化学试剂有限公司）磷酸二氢钠（国药集团化学试剂有限公司）10%过硫酸铵（Roche)N，N，N，N-四甲基乙二胺（武汉鑫华远医药化工制造有限公司）甘氨酸(Solarbio) -醋酸萘酯(Sclarbio)1.1.3 主要仪器 研钵（阿法埃莎化学有限公司）解剖器具一套（淮北正华生物仪器设备有限公司）冰箱(Haier)FA1004 型号的电子天平(上海良平仪器仪表有限公司，精度为 0.0001g)Centrifuge804R 冷冻离心机(Eppendorf) 烘箱(吴江市东远电热设备有限公司)DYY-4 型电泳仪(北京市六一仪器厂生产)DY CZ- 22A 型电泳槽(北京市六
8、一仪器厂生产)1-1000L 型微量移液枪（德国 Eppendorf 公司）凝胶成像系统(SYNGNE)1.2 试验方法试验方法1.2.1 酶样品的提取取鱼体肌肉、脑、肝、眼、血液、肾、脾、卵巢、精巢、心、鳃，用 0.9%生理盐水冲洗干净，称重 0.4g。用吸水纸吸干水分，置于研钵中，按 1：3(wv)加入01molL 的磷酸缓冲液(pH=70)，冰浴研磨，再用吸管将匀浆移入冷冻离心管中。最后 12000rmin 离心，反复离心至上清液清晰透明，取上清液置于冰箱备用。均在低温下进行。1.2.2 血清样品制备从鱼尾动脉采血 2-3ml，用少量的肝素抗凝，4放置 4 小时后，离心（10min，30
9、00/min）分离血清，用 0.5ml 离心管分装，-20保存备用。1.2.3 储备液及其制备表 1 不同浓度分离胶配制方法Tab1 Different concentrations of the separate rubber 分离胶的浓度/ml10%7.5%蒸馏水/ml4.054.851.5mol/L Tris-Hcl，pH8.8/ml2.52.5凝胶储备液/ml3.352.510的过硫酸铵/l5050TEMED/l4.054.85注：过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）采用浓度为 7.5%的分离胶；苹果酸脱氢酶（MDH）和谷氨酸脱氢酶（GDH）采用浓度为 10%分离胶。一般浓缩胶浓
10、度为 5 %， pH 6.8，其方法见下表 2表 2 5%浓缩胶配制方法Tab2 5% of methods of preparing rubber试剂蒸馏水/ml0.5mol/lTris-Hcl缓冲液（pH6.8）/ml凝胶储备液/ml10%过硫酸铵/ulTEMED/ul总体积用量2.921.250.8255101.2.4 凝胶制备将玻璃板和垫片依次用 5%的 KOH 甲醇溶液、去污剂和清水洗涤，晾干。将无凹口的玻璃板平放在桌面上；将垫片两面涂少许凡士林后，排放在玻璃两侧，再将有凹口的玻璃板在垫片上放置妥当。将玻璃夹层推至桌沿，用胶带纸封闭三个侧面，留出有凹口的一面不封闭。使玻璃夹层竖立，有
11、凹口面朝上。根据所需的凝胶浓度和用量，按表 1 的比例配制分离胶溶液。一旦加入 TEMED，混匀后立即小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为积层胶留有足够空间。用吸管轻轻在其顶层加入几毫升异丁醇，以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。聚合完成后（约 3060 分钟）后，倒掉覆盖液体，用蒸馏水洗凝胶上部数次，尽可能用吸水纸吸干凝胶顶端的残余液体。根据所需用量，按表 1 和表 2 的比例配制积层胶溶液。注入积层胶溶液，插入梳子，小心避免气泡，垂直放置于室温下。在积层胶聚合完成（约 30 分钟）后，小心拔掉梳子。用蒸馏水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺。将凝胶放入电泳槽中，上下槽均加入电泳缓冲液，
12、检查是否泄漏。驱除两玻璃板之间凝胶底部的气泡，即可上样。1.2.5 点样与电泳用微量注射器（50uL）吸取 3 微升样液然后再吸取 3 微升溴酚蓝混匀吸在一起，在浓缩胶上层点样，每个点样槽点一个组织并留一个空槽以辨认并且记下组织的顺序。点样时须小心，防止样品液的扩散。点样后开始电泳。电泳采用的是丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）具体步骤如下：（1）实验前 20min，倒入电极缓冲液，打开稳流稳压电泳仪，并在其四周敷上冰袋。（2）预电泳：将预先制备好的聚丙烯酰胺凝胶胶模装入电泳槽固定好，并在其四周敷上冰袋，在 50mA 电流下，预电泳 30min。（3）前电泳：预电泳结束后，关闭电源，用微量加样注射器
13、在每个点样孔内分别加入 3uL 待测样品（待测样品是所测样品和溴酚兰的混合物，其中所测样品和溴酚兰的体积比为 4：1。和 3uL 溴酚兰（指示剂） ，25mA 电流下，前电泳 10min 。（4）正式电泳：在 50mA 的电流下，正式电泳，电泳时间为 2.5h。1.2.6 剥胶与染色剥胶是用带有长针头的注射器，内装蒸馏水作润滑剂，把针头插入玻板内壁与凝胶表面之间，慢慢移动针头，同时注入水，靠水流压力与润滑将玻板与凝胶分开，剥出的凝胶用 3.5%醋酸固定 10min。倒入染色液，盖上包有黑纸的盖子，进行染色。不同同工酶的染色时间和染色配方不同。具体染色方法如下表：表 3 不同酶的染色方法Tab 3 The recipe of dyestuff for isozyme staining 酶类染色方法过氧化氢酶A：取 5ml3%过氧化氢 10ml 0.1mol/L pH=7.0 的磷酸缓冲液 7ml
