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1、中国医科大学博士学位论文MYOC基因在原发性开角型青光眼发病过程中的作用研究姓名：宁波申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：张忠志20090301中文论著摘要M Y O C 基因在原发性开角型青光眼发病过程中的作用研究目的青光眼是继白内障之后的第二位致盲眼病，原发性开角型青光眼( p r i m a r yo p e n - a n g l eg l a u c o m a , P O A G ) 是青光眼的主要和常见类型之一，P O A G 的发病机制至今尚未明确，倾向于认为遗传因素是主要病因之一。1 9 9 3 年S h e f f i e l d 等在一个青少年发病的P O A G 家
2、系成员的D N A 全基因组搜索中，发现了小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白基因突变的。1 9 9 7 年，P o l a n s k y 等在研究激素性青光眼时，发现了一个随着使用糖皮质激素作用时间的延长而表达增多的基因，它最初被命名为糖皮质激素诱导的小梁网反应蛋( t r a b e c u l a rm e s h w o r ki n d u c i b l eg l u c o e o r t i e o i dr e s p o n s ep r o t e i n ，T I G R ) 基因，1 9 9 7 年S t o n e 等的研究最终确定了T I G R 基因是原发性开角型青光
3、眼的致病基因，从此，对青光眼致病基因的研究开展迅速、普遍。同年，T I G R 基因被基因命名委员会( G e n o m eD a t a b a s eN o m e n c l a t u r eC o m m i t t e e ，G D N C ) 正式命名为M y o c i l i n ( M Y O C ) 基因。最近的研究发现：当小梁网的m y o c i l i n蛋白量过多( 分泌过剩或降解减少) ，可能阻塞小梁网房水外流导致房水流出阻力增加；突变形式的m y o c i l i n 蛋白无法被分泌和降解，大量异常的m y o c i l i n 蛋白沉积在小梁网细胞内质
4、网或细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，E C M ) ，通过细胞凋亡和或E C M 重排，影响到房水外流，使眼内压升高。M Y O C T I G R 基因受糖皮质激素调控，在糖皮质激素的诱导下表达水平显著上升，导致m y o c i l i n 蛋白聚集；另外，有文献报道，糖皮质激素体外作用于小梁网细胞可以造成内质网及E C M 重排，细胞的粘附、吞噬能力下降及细胞周期改变，由此可以看出，激素处理的体外培养的小梁网细胞其产生的病理生理变化与文献报道的P O A G 的小梁网细胞的病理改变极为相似，因此，我们采用地塞米松处理体外培养的小梁
5、网细胞，以便制作出近似P O A G 发病的病理生理改变，并运用s i R N A 干扰技术探讨M Y O C 基因在P O A G 发病过程中的作用。方法l 、大鼠小梁网细胞的培养及鉴定：将体外培养的3 代小梁网细胞用于细胞鉴定及实验。细胞免疫组织化学鉴定：3 代细胞达到融合以后，进行抗兔的纤维粘连蛋 刍( f i b r o n e c t i n , 踟、层粘连蛋白( 1 a m i n i n ，L N ) 和神经元特异性烯醇化酶( n e u r o n s p e c i f i ce n o l a s e ，N S E ) 的免疫细胞化学染色鉴定。2 、地塞米松培养大鼠小梁网细
6、胞、培养后M Y O C 基因表达量的改变及细胞凋亡率检测：3 代的大鼠小梁网细胞，用终浓度为1 0 7 M 地塞米松的1 5 F B S 培养基培养7天，观察地塞米松处理后的细胞数目、形态、凋亡率的变化情况，并运用R e a l t i m eP C R 方法检测M Y O C 基因表达量的改变。 3 、检测O C 基因作用：( 1 ) M Y O C 突：变分析：运用R T - P C R 方法扩增U r O C 基因的c D N A ，测序，并进行突变分析。( 2 ) s i R N A 干扰技术：设立三个组别，分别为空白组，空质粒干扰组及地塞米松处理组，运用s i R N A 干扰各个
7、实验组的大鼠小梁网细胞，观察s i R N A 干扰后地塞米松处理组与正常细胞组比较后的细胞数目、形态、凋亡率的变化情况。结果1 、大鼠原代小梁网细胞倒置显微镜观察结果组织块接种后5 , - - , 1 0 天，开始有细胞从组织块边缘向外生长或者在组织块周围见数个游离的细胞群落。显微镜下细胞形态多样：梭形，椭圆形，不规则形等，细胞体积较大。细胞形态介于上皮细胞和成纤维细胞之间。原代细胞生长缓慢，一般需要1 0 “ “ 1 5 天才能达到融合，形成单层贴壁细胞，融合以后细胞形态逐渐接近。2 、传代的大鼠小梁网细胞倒置显微镜及透射电镜结果( 1 ) 倒置显微镜观察：传代的大鼠小梁网细胞形态一致，多
8、呈梭形，类似成纤2维细胞形态，融合以后细胞密度较高，细胞体紧密相连，可以形成漩涡状匍匐生长的单层贴壁细胞，高倍下可以看到细胞胞体较大，胞质丰富，胞体多突起。传代细胞生长较快，多在5 7 天便可以融合。( 2 ) 透射电镜观察：大鼠小梁网细胞胞体多突起，表面微绒毛多见。细胞核呈圆形、椭圆形，位于细胞中央，边缘常见凹陷，核仁明显，核膜清晰，核内染色质呈细颗粒状分散不均匀，密度较高。胞质内溶酶体、内质网及线粒体丰富，并且含有大量的微管及微丝，且多在细胞核附近。3 、培养细胞的免疫细胞化学染色鉴定结果( 1 ) 纤维粘连蛋白染色：小梁网细胞染色阳性，细胞质呈棕黄色，颗粒状，有些彼此相连呈网状。( 2
9、) 层粘连蛋白染色：小梁网细胞染色阳性，细胞质呈棕黄色，颗粒状，也可彼此连接成网状。( 3 ) 神经元特异性烯醇化酶染色：小梁网细胞染色阳性，细胞质呈棕黄色，颗粒状，也可彼此连接成网状。4 、细胞生长曲线：细胞增殖速度并不是按直线增加，到7 天增殖速度开始减慢，细胞数目变为平台期。5 、1 0 。7 M 地塞米松培养7 天后细胞倒置显微镜及透射电镜结果( 1 ) 倒置显微镜：与未干扰前正常细胞相比，细胞密度降低，形态变化不大，但细胞有收缩的趋势。( 2 ) 透视电镜：细胞出现凋亡改变，包括细胞核固缩，细胞核内细胞质边集，细胞质浓缩，细胞器肿胀，微管微丝溶解甚多，核周可以出现空泡区域等等。6 、
10、地塞米松培养小梁网细胞的M Y O C 基因测序结果R T P C R 扩增出1 8 7 2 b p 的c D N A 片段，包括全长功能区的1 5 0 9 b p 碱基序列，测序后的序列与G e n B a n k 数据库对比分析符合率 9 9 ，没有发现突变位点。7 、正常细胞组、地塞米松处理组、地塞米松培养细胞s i R N A 干扰组M Y O C 基因表达量分析r e a l t i m eP C R 结果：3( 1 ) M Y O C 基因的干扰率最高可达8 5 8 。 ( 2 ) 正常小梁网细胞脚C 基因相对含量为约为( 1 8 7 士0 0 9 ) x l O 。2 P g(
11、M e a n - 士S t d ) ；地塞米松培养的小梁网细胞M Y O C 基因表达相对含量约为( 2 8 9 3 “ 4 - 1 2 0 ) x l O 2 P g ( M e a r l 士S t d ) ；地塞米松培养组是正常细胞细胞组含量的1 5 4 7 士0 7 0 倍( M e a n a ：S t d ) ；两组细胞册D C 基因表达量对比幸萨0 0 5 ，差异有统计学意义。( 3 ) 地塞米松培养后s i R N A 干扰组M Y O C 基因的相对表达量为( 5 2 2 - L 0 6 6 )1 0 2 P g ( M e a n - q ：S t d ) ；D e x
12、培养细胞对照组表达量为( 2 8 3 2 4 - 0 7 0 ) x 1 0 “ 2 p g( M e a n a ：S t d ) ；两组数据进行t 检验，p 9 9 ，图中“t ”表示与数据库比较的不同之处( T c ，A _ G ) 。分别位于3 2 、3 3 个碱摹，由于均是测序的两端，有可能是测序造成的，没有生物学意义。4 、大鼠小梁网细胞凋亡检测结果：见图8 、图9GjG0iii=三t讥、ti ，ciG6ii虬GjiiiD Q u 蛔* 钿蝴u L0 U R0 2 1L L惦：、氓4 4 0 测羹、? 。 黪 订D a t a 嘲西紫：蕊：二 1 潮麟誊。 、：! ”，Q _ 蛔C
13、 曲 U I _ 0 1 1 U R2 8 B L L5 7 8 4t R2 t 9图8 ：正常大鼠小粱网细胞凋亡 率( ) 检测图图9 ：D 既培养的大鼠小梁网细胞凋 亡率( ) 检测图- L - - n如图8 所见：正常3 代大鼠小梁网细胞的凋亡率为4 5 1 H ：0 4 1 ( M e a n - - b S t d ) ；由图9 所见：1 0 7 MD e x 培养的小梁网细胞的凋亡率为2 9 3 5 + 0 4 7 ( M e a n - q ：S t d ) ；两组凋亡率进行t 检验，掌p O 0 5 ，两者差异具有统计学意义。注：图左下象限代表正常的活细胞，右下象限代表凋亡早期
14、的细胞，左上象限代表许可范围内的检测误差，右上象限代表坏死细胞和凋亡晚期的细胞。讨论长期接受糖皮质激素治疗的某些对激素的易感患者，就会导致激素性青光眼的发生【2 2 1 。地塞米松导致眼压升高会出现各种变化，比如小梁网细胞的房水排除系统中，包括金属离子2 3 1 ，纤维连接蛋白和类胶原蛋白的增高及基质金属蛋白酶表达的下斛2 4 】等等。在接受地塞米松治疗产生高眼压以及对于由地塞米松所导致的小梁网细胞发生变化的遗传学原因的研究中，人们对m y o c i l i n ( M Y O C ) 基因特 别关注。因为在采用激素人工培养小梁网细胞并检测姗C 基因表达水平的实验中发现了M Y O C 基因
15、表达的上调，因此 循D c 基因开始被作为激素性青光眼研究的候选基斟挣】。同样，有文献报道，长期接受地塞米松的治疗会诱导M Y O C T I G R基因表达的m y o c i l i n 蛋白的上调【”l ，从而影响到上述的个以上的细胞变化过程。2 8-o I摹铲t -。2飞n 暑孔L1 0 I -o D l以上研究结果的发现，提示- 了m y o c i l i n 蛋白可能引起的小梁网细胞的一些变化，如蛋白的整合、微管微丝的运动减弱等等，M y o c i l i n 蛋白的增加导致小梁网细胞正常维持房水外流的能力减弱，这有可能使得眼内压升高【2 6 】。在糖皮质激素性青光眼发病过程中
16、，是否是由于m y o c i l i n 蛋白表达的增加导致了眼内压的升高，或者是由于小梁网细胞自身代谢紊乱导致的非突变性的m y o c i l i n 蛋白数量的增加，从而引起眼压的变化【2 7 1 ，至今尚未明确。由于糖皮质激素性青光眼的很多改变都与原发性开角型青光眼相似，例如病理生理过程，因此糖皮质激素性青光眼很可能成为研究P O A G 的疾病模型。虽然我们在P O A G 患者中发现了许多M r O C 基因的突变位点以及S N P s ，但是，几乎没有发现突变的M Y O C T I G R 基因，造成激素易感性增加而诱导了激素性青光眼的发生【2 引，这与我们的研究结果是相似的，我们的研究中也没有发现 描D C 基因的突变位点。我们利用1 0 。7 M 的地塞米松诱导M Y O C 基因表达量增加了1 5 倍，有国外的学者曾经做过实验竟然发现此基因在激
