《中药复方颈舒片治疗大鼠神经根型颈椎病的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中药复方颈舒片治疗大鼠神经根型颈椎病的实验研究（122页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、耻京中署蒜大辱B E I J I N GU N I V E R S I T YO FC H I N E S EM E D I C I N E博士研究生学位论文题目：中药复方颈舒片治疗大鼠神经根型 颈椎病的实验研究专业研究方向博士生导师药理学 中鳓r 周神经退行性变中的作用机制窦夏睿孙建宁教授o o 六年六月独创性声明y8 6 8 8 2 1本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特另d J J n 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京中医药大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对
2、本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。魏掇鲁慨伽“夕关于论文使用授权的说明本人完全了解北京中医药大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 骅嗍型f )中文摘要中文摘要颈椎病是导致外周神经退行性变的常见疾病，原本是中老年的常见病和多发病，但近年来，由于人们生活习惯的改变和诊断技术提高等原因，该病的发病年龄有不断下降的趋势，已不单纯是中老年病了。颈椎病各种分型中，神经根型颈椎病在临床上最多见，呈慢性经过，反复发作。
3、该病属中医痹证和痿证范畴。目前已有研究发现，颈椎病的发病和进展同炎症因素关系十分密切。复方颈舒片( F F J S T ) 是多年经验方结合现代工艺加工而成的新药，由川芎、白芷、天麻、狗脊和杭菊花组成，经临床观察，该方具有疏风活血，强筋壮骨、通络止痛的作用，尤其在颈椎病神经根型患肢麻木疼痛的治疗方面，有确切疗效。本研究采用生物电测定、酶联免疫分析、放射免疫测定、免疫组织化学、实时荧光定量聚合酶链反应等手段，从胶质细胞的激活、炎性细胞因子表达、环氧合酶激活以及转录因子活化等炎症环节探讨了复方颈舒片对神经根型颈椎病模型大鼠炎症反应的干预作用及可能的作用机理。l 卡压性神经根型颈椎病模型的建立目的：
4、建立快速、准确、简单、经济的急性神经根型颈椎病模型。方法：采用椎管插线法，对大鼠颈髓背根神经造成持续卡压，建立神经根型颈椎病动物模型。并对造模后大鼠的一般情况，运动功能，感觉功能，以及局部脊髓、后根、神经节等部位的病理改变等进行了系统观察。结果：造模后大鼠在一周之内出现了明显的外周神经症状，机械压痛的耐受阈值明显降低，体感诱发电位传导时间延长，并有背根神经节内神经元坏死、后根神经脱髓鞘、脊髓后索及外侧索空泡样变等病理改变。但是动物的运动能力、肱二头肌张力、肌肉重量等均没有明显变化。结论：利用椎管插线法，可以使大鼠出现明显的感觉神经系统障碍的表现。这与临床神经根受压后出现的疼痛、感觉异常等神经根
5、功能紊乱的症状和体征十分类似。在后期的深入研究中，大体选择了造模后3 天、7 天、1 4 天这3 个时间点进行相关指标的观察。研究过程中发现，本模型症状出现( 痛觉过敏、髓鞘结构和功能改变、胶质细胞激活等等) 较早，3 天即可见到明显改变，并且持续稳定发展到术后1 4 天。症状的早期出现，这同局部组织中炎症细胞因子( I L 一1B 、I L 一6 ) 早期( 术后3 天) 增多有关。症状的持续进行，同细胞信号转导通路各关键蛋白质的表达持续增多有关。除了N F KB 在术后7 天才有明显表达外，其他IKB 、I K K 、J A K l 、S T A T 3 、S O C A 3 m R N
6、A 等表达均较早而且持久，可以持续到造模后1 4 天，这些蛋白是调节与疼痛密切相关的物质( I L 一6 ，C O X 一2 等) 的转录以及持续释放的重要物质，而后者又是导致根性痛的直接原因。这从一个层次上说明了本模型痛觉敏感比较突出而且持久的原因。因此该法可以作为研究急性期神经根型颈椎病和神经根性疼痛的研究模型。同其他化学性炎症模型不同的是，本模型炎细胞( 如白细胞、巨噬细胞) 浸润的现!主垫复直塑墅苎塑蕴苎丝堡型塑鳖堡墼塞墼堡塑象并不突出。这可能与血液中P G E 。，组织中的C O X m R N A 的升高均出现在7 天以后有关。说明本模型造成的炎症和化学物质刺激造成的炎症不尽相同，
7、主要是通过胶质细胞和细胞因子的作用实现的，而白细胞等炎性细胞作用居于次要地位。2 复方颈舒片对不同外周神经疼痛模型感觉功能的影响目的：观察复方颈舒片对不同外周神经疼痛模型感觉神经系统功能的影响。方法：采用生物电测定，测量药物对颈椎插线法大鼠模型正中神经体感诱发电位( S E P ) 传导时间的影响。同时利用坐骨神经结扎和颈椎插线法建立大鼠外周神经疼痛模型，分别测量该药物对机械压痛的耐受阈值的影响。结果：中药对造模后患侧S E P 延长的病理改变，有很好的治疗作用，而且疗效发挥较快。中药大、中、小剂量组给药后3 天即可显著加快患侧S C T ，且中药中剂量组可显著缩短患侧C C T ，同健侧比较
8、差异均已不显著：给药后7 天，中药各剂量组S C T 和C C T 均明显加快，同健侧比较均无明显差异。C C I 模型和神经根型颈椎病模型在术后均出现了患侧机械压痛耐受阈值明显下降的病理改变。给药后，卡压型神经根型颈椎病模型患侧机械压痛的耐受闽值在1 4 天得到显著提高：给药后7 天中药小剂量组在可以显著提高C C I 模型的机械压痛耐受闽值。结论：复方颈舒片具有明显的提高感觉神经传导性和一定的改善痛觉敏感的作用。3 复方颈舒片对神经根型颈椎病模型神经胶质细胞的影响目的：观察该药对神经根型颈椎病大鼠脊髓中枢和外周神经主要神经胶质细胞星形胶质细胞和雪旺氏细胞的结构和功能影响。方法：利用椎管插线
9、法建立大鼠神经根型颈椎病模型，用快兰染色观察中枢和外周神经髓鞘的完整情况，利用免疫组化法观察与髓鞘结构密切相关的髓鞘碱性蛋白( M B P ) 和星形胶质细胞特有的胶质原纤维酸性蛋白( G F A P ) 的表达睛况。结果：模型组脊髓白质后索和外侧索脱髓鞘区域面积和空洞数目远远高于假手术组；各给药组均可不同程度地降低脱髓鞘区域面积和空洞数目，尤其对外侧索的改善作用更为突出。假手术组仅有少量M B P 和G F A P 表达，模型组表达显著升高；各给药组均可不同程度降低阳性表达的面积以及积分光密度值。结论：复方颈舒片能保护神经髓鞘，抑制后根神经受压后引起的中枢和外周脱髓鞘反应，抑制中枢星形胶质细
10、胞的激活。4 复方颈舒片对神经根型颈椎病模型炎症细胞因子表达的影响目的：观察该药对神经根型颈椎病大鼠局部神经组织内炎症细胞因子含量及其m R N A表达的影响。方法：利用椎管插线法建立大鼠神经根型颈椎病模型，造模给药后3 天，制作局部神经组织匀浆，取上清液以E L I S A 法测定其中I L _ lB 、I L - 6 的含量；造模及给药后7 天、1 4 天，取局部神经组织以实时荧光定量P C R 技术，测定I L 一6 m R N A 的表达情况。结果：造模后3 天大鼠局部神经组织内细胞因子I L - 1B 、I L - 6 水平明显升高，各给药组均可明显降低模型大鼠I L 一1B 、I
11、L 一6 含量。造模后7 天，模型I L 一6 m R N A 表达有增高趋势；造模后1 4 天，模型组I L 一6 m R N A 表达量达到指数扩增的循环次数显著降低，中文摘要3说明其含量显著升高，中药大剂量和阳性药组可显著升高循环次数，降低I L 一6m R N A 的表达。结论：复方颈舒片能显著降低局部神经根受压后所导致的神经组织炎性细胞因子的高水平表达。5 复方颈舒片对神经根型颈椎病模型环氧合酶表达的影响目的：研究该药对神经根型颈椎病模型大鼠血浆前列腺素E ：( P G E 。) 的含量以及局部神经组织环氧合酶2 ( C O X 一2 ) 蛋白和m R 表达的影响。方法：造模后3 天
12、、7 天、1 4 天，分别从大鼠颈总动脉取血，分离血浆，以放射免疫法测定P G E ：的含量；取造模后7 天、1 4 天压线局部脊髓组织石蜡切片，以免疫组织化学方法观察C O X 一2 蛋白表达；取7 天、1 4 天取局部神经组织制成组织匀浆，以实时荧光定量P C R 技术，测C O X 一2 m R N A的表达。结果：血浆中的P G E 2 在术后7 、1 4 天明显增高，中药大、中剂量组能明显降低P G E ：含量。C O X - 2 在假手术组仅有少量表达，模型组则呈大量表达，阳性表达面积与积分光密度明显增加；药物治疗后C O X 一2 表达面积均有不同程度明显降低，中药大、中剂量组对
13、I O D 值也有较明显的降低作用。手术后7 天，模型组C O X - 2 m R N A 表达显著升高，中药大剂量组可下调C O X - 2m R N A 的表达。术后1 4 天，模型组C O X 一2 m R N A 表达含量下降，和假手术组相比差异已不明显。结论：复方颈舒片能抑制C O X 一2 的异常表达及激活，降低P G E 2 的合成和释放。6 复方颈舒片对神经根型颈椎病模型N F Kn IKB 信号传导因子的调控目的：研究该药对神经根型颈椎病模型大鼠局部神经组织中N F - KB 、IKB 、I K K 表达的影响。方法：造模后3 天、7 天、1 4 天，取压线局部脊髓组织石蜡切
14、片，以免疫组织化学方法观察N F KB 、IKB 、I K KQ 蛋白的表达，并做图像分析。结果：此三者在假手术组动物都有少量表达，表达的主要位置基本一致，均在脊髓后角神经元胞体细胞浆内以及突起的起始部分。模型组动物造模后3 天，IKB 、I K Ko 表达均开始有所增多，而N F KB 阳性表达则从造模7 天才开始明显增多，N F xB 部分细胞表达物发生核易位，细胞核中出现深棕黄色颗粒。用药后7 天、1 4 天N F KB 核易位均明显减弱，其免疫反应阳性表达物多在胞浆与核中共存，阳性面积和积分光密度明显降低；对于IKB ，中药组在3 天时对模型动物作用较弱，用药7 天、1 4 天后，能显
15、著提高IKB 表达积分光密度值；同时该药能降低各个时间点上I K Ko 的表达，对积分光密度值的影响比对表达面积的影响更大。结论：复方颈舒片能抑制核转录因子N F KB 的活化和核易位现象。这种作用同它能够抑制I K K 的活性，减少IKB 的水解，增强N F KB IKB 复合物的稳定性有关。4中药复方颈舒片治疗神经根型颈椎病的实验研究7 复方颈舒片对神经根型颈椎病模型J A K S T A T 信号转导通路的调控目的：研究该药对神经根型颈椎病模型大鼠局部组织中J A K I 、S T A T 3 表达以及J A K S T A T 通路负反馈调节因子S O C S I 和S O C S 3
16、 的m R N A 的表达量的影响。方法：造模后3 天、7 天、1 4 天，取压线局部脊髓组织石蜡切片，以免疫组织化学方法观察J A K I 、S T A T 3蛋白的表达，并做图像分析。造模后7 天、1 4 天，取局部神经组织制成组织匀浆，以实时荧光定量P C R 技术，测S O C S I m R N A 和S O C S 3 m R N A 的相对含量。结果：假手术组J A K I和S T A T 3 表达均很弱，造模后阳性表达均明显增多，表达部位除了在神经元胞体的胞浆内及轴突起始段外，还出现在胶质细胞胞浆和突起，S T A T 3 的核易位现象不甚明显。各给药组均能不同程度地降低J A K I 和S T A T 3 的表达强度。实时荧光定量P C R 测定结果表明，S O C S I m R N A 仅有表达增高的趋势，但没有得出统计意义。而S O C S 3 m R N A 达到指数扩增的循环次数在7 天与1 4 天均显著降低，说明其含量升高，中药大剂量可进一步降低循环次数，增加S O C S 3m R N A 的表达。结论：复方颈舒片能抑制J
