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1、内蒙古医学院硕士学位论文幽门螺杆菌iceA基因型的分布及对胃上皮细胞增殖的影响姓名：刘彦琦申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：苏秉忠20060501中文摘要O目的研究幽门螺杆菌( H e l i o d b a c t e rp y l o r i 简称 p ) i o e A 基因与胃十二指肠疾病的关系及其对胃上皮细胞增殖的影响，旨在寻找 I p 不同基因型的分布特点及其导致胃癌发生的分子机制。方法从1 6 4 例胃十二指肠疾病( 包括慢性浅表性胃炎C 9 G 3 2 例，慢性萎缩性胃炎C A G 7 0 例，消化性溃疡P U D 3 2 例，胃癌G C 3 0 例) 患者的胃粘膜活检组
2、织中分离培养并经系统鉴定确认为H p 者，传代培养2 天扩增细菌，用标准方法提取H p 基因组D N A ，进行P C R 扩增检测H pi c e A 基因。将胃粘膜活检组织标本用甲醛溶液固定后，用免疫组化S P 法检测胃上皮细胞的增殖情况。i c n 基因与不同疾病关系的分析采用x ? 检验，各疾病组增殖指数的比较采用t 检验，P 0 0 5 ) 。胃上皮细胞增殖指数在i c e A 基因阳性组分别为C S G l 2 2 l 2 3 3 ，S C A G l 9 9 0 3 6 1 ，m 心7 4 6 3 8 6 ，D Y S 3 8 6 7 = 4 0 2 ，G C 4 8 2 9 5
3、 7 9 ，阴性组分别为C S G 7 6 1 2 8 9 ，S C A G l 5 8 9 2 5 9 ，I M 2 5 0 9 2 8 7 ，D Y S 3 5 7 6 2 4 8 ，G 0 4 6 3 9 3 2 8 。i 。n 基因阳性组在浅表性胃炎和萎缩性胃炎阶段增殖指数显著高于i o 以基因阴性组( P0 ，0 5 ) P r o l i f e r a t i o no fG a s t r i cE p i t h e H a lC e l l mi c e ”w a sC S G l 2 2 1 2 3 3 ，顶A G l 9 9 0 3 6 1 ，m 凹4 6 3 8 6
4、，D Y S 3 8 6 7 4 舵，G C 4 8 2 9 5 7 9 ，i c e A w a sC S G 7 6 1 2 8 9 ，S C A G l 5 8 9 2 5 9 ，I 忿5 0 9 2 8 7 ，D Y S 3 5 7 6 2 4 8 ，G C 4 6 3 9 3 2 8 P r o U f e r a t i o no fg a s t 血e p i t h 出a Ic e ui I li c e A + w a Sh i g h e rt h a l li c 已A o fC S Ga 1 1 dS C A G C 鲫c I 璐i o 璐T h ei c e Ap o
5、 s i t i v ei c e A lg e n a t y p ew a sp r e d o 嘶n a n ti nt l i ss t l j d y T h e r ew a sn oc o r r e l a t i o nb e t w e e ni c e Ag e r l ea n dv a I i o u sg a S t r o d e n a 上d i S e I S e S I c 以g e I 】0 t ) ，p ew a sc a nn o tb e0 0 n s i d e r e dm a r k e r sw l i c hw a sm o r ep a
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7、垒兰丝鎏塞( 垫堕至!幽门螺杆菌i c e A 基因型的分布及对胃上皮细胞增殖的影响0 前言自1 9 8 3 年澳大利亚学着在人胃粘膜活检组织中成功分离培养出H p 以来，H p 与其相关性胃肠疾病的研究进展迅速。目前研究表明，H 口是慢性胃炎和消化性溃疡的主要 病因，与胃癌和胃粘膜相关组织淋巴瘤( M A L T ) 的发生密切相关“。】。1 9 9 4 年嘲国际癌症协会已经将H p 列为I 类致癌因子。流行病学研究显示1 3 ，全世界 I p 的感染率为5 0 ，发展中国家甚至达到8 0 。然而，H p 感染的人群大多数无症状，只有少数发展成消化性溃疡，极少数发展成胃癌及胃牯膜相关缀织游巴
8、瘤。目前认为， p 感染后临床结局的不同除了与环境因素宿主基因的易感陛有关外，更重要的是受H p 菌株的毒力差异影响“。H p 致病因子”分两类：一类是定植因子，此为H p 感染的首要条件决定H p 在体内的定居，存在于所有H p 菌株中。另一类是毒力困子，决定H p 感染后是否导致炎症、溃疡以及肿瘤的发生。目前已知的毒力因子主要包括：L P s 、尿素酶、V a c A 基因、c a g A 基因、i c e A 基因等。C a n 基因与、，a c A 基因已经证实与胃癌发生密切相关。k e A 基因”( i n d u c e db yc o n t w i t he p l t h e
9、 l i u m ，简称i c e A 基因) 是H p 与胃粘膜上皮细胞接触后诱导表达的基因，包括- c e A l 和c e A 2 两个等位基因，分别存在于不同的H p 菌株中，部分研究显示”j ，i c e A l 基因与消化性溃疡的发生密切相关，而具有i c e A 2 的 I p 菌株与慢性胃炎和胃癌的发生相关，但也有相反观点认为i c e A 2 与消化性溃疡关系密切。关于，c e A 基因与胃十二指肠疾病关系及其致病机制的研究目前尚无定论。胃癌的形成是多因素影响的多阶段发展过程，H p 的致癌机制目前仍不清楚，医学界普遍认为，胃癌的发生经历慢性浅表性胃炎慢性萎缩性胃炎一肠化生异
10、型增生和癌变的演变过程。H p 致癌的可能机制”。包括：H p 及其产物导致胃粘膜上皮细胞增殖凋亡的失衡；炎症反应产生的多细胞因子；氧自由基和N O 导致的细胞增殖和D N A殖胴亡的失衡；炎症反应产生的多细胞因子；氧自由基和N O 导致的细胞增殖和D N A囱蓥直里堂睦塑圭堑塞生堂焦迨塞! ! ! ! 生20损伤；抗氧化物减少以及胃粘膜萎缩导致的内源性亚硝基化合物的产生等。对于究竟是何种H p 组分在胃癌的发生中起作用，目前还不十分清楚，而寻找H p 的致病组分及其导致胃癌发生的可能机制对于H p 感染的防治以及疫苗安全性的评价具有十分重要的意义。胃粘膜细胞的增殖是重要的生理活动过程，对于维
11、持胃粘膜的正常状态和功能有着重要的作用。已有研究表明，在多种致癌因子作用下，细胞增殖增强是肿瘤形成及肿瘤浸润和转移的生物学基础。因此，研究H p 对胃粘膜细胞增殖的影响，对于弄清 I p 的致病作用和机制具有重要的意义。在探索H p 致胃癌发生的机制中，大量的在体研究表明H p 感染可促进胃上皮细胞增殖阳3 ，而H p 毒力因子是否能导致胃粘膜上皮细胞的增殖发生异常，有待进一步研究证实。鉴于此，本研究利用P C R 技术检测H pi c a A 基因，使用免疫组化技术检测胃上皮细胞的增殖情况，从而探讨H pi c e A 基因与胃十二指肠疾病的关系及其导致胃癌发生的分子机制，为H p 感染的防
12、治提供重要的理论依据。1 材料与方法1 1 实验仪器与试剂1 1 1 实验仪器8 2 5 A 型厌氧培养罐U 一3 4 1 0 紫外可见分光光度仪U L 丁1 3 8 6 3 一V 1 4 型低温冰箱H F 一2 0 型显微镜高速低温离心机紫外反射透射分析仪D Y Y 一3 7 型转移电泳仪电热恒温水温箱G I S 一2 0 0 8 凝胶成像及分析系统1 1 2 主要试剂沈阳市第五人民医院日本H I n 托H I 公司生产美国R e v c oS c i e n t i f i c 公司日本O L Y 平U S 公司德国H e r a e u s 公司生产温州医疗仪器厂制造北京六一厂生产P E
13、 R K I NE L M E R 公司上海天能科技有限公司生产。囱鏊直匡堂暄塑主班塞圭堂焦鲨銮f ! 盟i 生2r E 缓冲液，溶菌酶，S D S ，蛋白酶K ，琼脂糖，氯仿，异戊醇，聚合酶，微需氧气体，均为大连宝生物工程公司提供。引物：根据文献报道m ，由大连宝生物公司合成。见下表表1i o e A 基因P C R 引物设计S ；q G ；Y ；q T ；R = d A1 1 3 培养基( 1 ) S k i r r o w s 选择性培养基蛋白胨1 5 9 ，胰蛋白胨2 5 9 ，酵母浸出粉5 9 ，氯化钠5 9 ，琼脂粉1 5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 r n l溶解后高温灭菌。选择
14、性培养基中加入磺胺增效剂( T M P ) 5 m d l ，多粘菌素B 2 5 0 0 U L ，1 0 m d l 万古霉素。应用时加入8 的脱纤维羊血。( 2 ) 布氏肉汤胰蛋白胨1 0 9 ，蛋白胨1 0 9 ，葡萄糖1 0 9 ，酵母浸出粉2 O g ，氯化钠5 0 9 ，重亚硫酸钠O 1 9 ，蒸馏水1 0 0 0 甜，溶解后高压灭菌。应用时加入5 的灭活小牛血清。( 3 ) 冻存液含3 0 甘油及5 小牛血清的布氏肉汤。1 2 病例选择2 0 0 4 年7 月一2 0 0 5 年1 0 月因消化道症状就诊于内蒙古医学院附属医院确诊的感染患者1 6 4 例，男性8 0 例，女性8
15、4 例，年龄1 9 8 0 岁，平均4 6 6 3 岁。其中C S G 3 2例，C A G 7 0 例( 包括单纯萎缩性胃炎S C A G 2 6 例，萎缩性胃炎伴肠化I M 2 2 例，萎缩性胃炎伴异型增生U Y 2 例) ，P U 】) 3 2 例( 胃溃疡1 4 例，十二指肠溃疡1 8 例) ，G C 3 0 例。排除四周内使用过铋剂，质子泵抑制剂和非甾体类抗炎药的患者。诊断标准： 如感染的诊断采用2 0 0 3 年安徽桐城I _ I p 共识意见，c 1 4 呼气实验及快速尿素酶实验均阳性诊断为 I p 阳性。所有患者诊断均经胃镜及病理检查确诊，病理由两位有经验的病理医师确定。取材时
16、所有患者取胃窦及胃体部粘膜组织各1 块做快速直鏊直墨堂堕堡圭亟窒垒兰焦盗塞l 垫竖垒20尿素酶实验，胃窦部l 块做细菌培养，2 块做免疫组化，2 块做病理检查。1 3H 晒的分离培养及鉴定”31 3 1H p 的分离培养将用于H p 培养的活检组织存放在O 9 的氯化钠溶液中，于四个小时内在研磨器中轻轻研磨8 1 0 下，用接种环采用直接划线法接种于s k i r r l 。w s 选择性培养基上。将培养基置人底部装有消毒蒸馏水的厌氧罐中，并应用负压抽空罐内空气，缓慢注入混合气体( 5 0 ：1 0 0 0 2 8 5 N 2 微需氧) 后，置3 7 0 C 的恒温培养箱中培养5 天观察分离效果。1 3 2H p 的鉴定( 1 ) 菌落性状鉴定培养5 天时观察培养皿上菌落特征
