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1、中山大学硕士学位论文RNA干扰iNOS基因对舌鳞癌细胞增殖活性及VEGF表达抑制的实验 研究姓名：杨岚申请学位级别：硕士专业：口腔临床医学指导教师：陈伟良20060418中山大学硕士论文R N A 二| 二扰i N O S 基因对舌鳞癌细胞增殖活性及V E G F 表达抑制的实验研究R N A 干扰i N O S 基因对舌鳞癌细胞增殖活性及V E G F 表达抑制的实验研究专业：口腔颌面外科研究生：杨岚导师：陈伟良教授摘要舌鳞状细胞癌( t o n g u es q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a ，T S C C ) 是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一。
2、手术、放疗、化疗是目前主要的治疗手段，但总的5 年生存率仍只有6 0 左右，患者的生存质量也不高。因此除现有的治疗方式外，针对造成肿瘤细胞无限增殖的特性，在基因水平进行治疗，将不失为一种非常有前途的肿瘤治疗策略。一氧化氮( n i t r i co x i d e ，N O ) 是生物体内一种小分子气体，一种结构简单的自由基，具有氧化还原性。它在体内发挥着十分重要的生理功能，参与了调节生物体的循环、神经、免疫等一系列生理、病理过程。大量的临床和实验研究表明，N O 对肿瘤发生、发展、转移过程发挥着“双刃剑”的作用。N O 在发挥抑瘤作用的同时，还具有促进肿瘤生长、发展、侵袭、转移的作用。而N
3、O 最终对肿瘤发挥何种作用，与肿瘤组织局部N O 浓度、肿瘤类型、以及肿瘤细胞对N O 的敏感性等多种因素有关。近期的研究发现，N O 与一些与肿瘤细胞凋亡相关因子相互作用，抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞的增殖。更有研究发现，N O 与肿瘤的血管形成密切相关。内源性N O 是由一氧化氮合酶( n i t r i co x i d es y n t h a s e ，N O S ) 以L 一精氨酸为底物氧化合成的。因此了解N O S 在体内的表达是衡量内源性N O 的重要指标。生物体内的N O S 至少有三种类型，分别为神经型( n N O S ) 、内皮型( e N O S ) 、诱导型(
4、i N O S ) 。其中i N O S 作用缓慢而持久，其产生的N O 量较多。大量的研究表明许多肿瘤细胞中可见i N O S 的表达。新生血管的形成是肿瘤的生长和侵袭转移的基础。肿瘤组织必须不断的产生中山大学邶i - I ：论文R N A 干扰i N O S 基因对舌鳞瑞细胞增殖活性及V E G F 表达抑制的实验研究新生血管，刁请E 维持其继续生长。肿瘤血管生成受血管生成促进因子和血管生成抑制因子的共同凋控。肿瘤的血管形成则表明二者之间的平衡状态被打破。血管内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r
5、 ，V E G F ) 是肿瘤新生血管形成最重要的细胞因子，通过一系列作用促进肿瘤的发展。近期的研究发现：N O 也是促进肿瘤血管形成的细胞因子，并与V E G F 相互作用，共l 司促进肿瘤血管的生成。许多研究都表明，i N O S 和V E G F 与肿瘤血管生成密切相关。R N A 干扰( R N A i n t e r f e r e n c e ，R N A i ) 是一种由双链R N A ( d o u b l e s t r a n d e dR N A ，d s R N A ) 抑制细胞内源性基因表达的现象。它是动植物生物体内普遍存在的一种现象，是生物体在进化上的种保守的基因组
6、水平的免疫监控机制。自从1 9 9 8年F i r e 在对线虫的研究中偶然发现R N A i 这一现象以来，R N A 干扰技术做为一种新的分子医学研究的手段，由于其高稳定性、高效率性、高特异性、可遗传性和合成简便等特性，很快就成为众多学者进行反向遗传学研究的一种行之有效的分子生物学工具之一。在本课题的研究中，我们采用了R N A 干扰技术，通过质粒表达载体的形式，将i N O S 基冈的特异性短发夹状R N Af s h o r th a i r p i nR N A ，s h R N A ) ) ；- 断转染入舌鳞癌T c a 8 1 1 3 绌胞中。流式细胞仪和M T T 法分别检测T
7、 e a 8 1 1 3 细胞的凋亡和增殖活性的变化情况；通过R T - P C R 和W e s t e r n b l o t t i n g 等实验检测技术，分别从m R N A 水平和蛋白表达水平检测i N O S 和V E G F 基因的表达改变情况。以进一步探讨i N O S 基凶是否存在对T c a 8 1 13 细胞中V E G F 基冈的表达调控。本研究分两个部分进行：第一部分：R N A 干扰i N O S 基因对舌鳞癌细胞增殖活性影响的实验研究为研究N O 和i N O S 对肿瘤细胞凋亡和增殖活性的影响，本实验用脂质体L I P O F E C T A M r N E2
8、 0 0 0 介导，将由武汉晶赛公司设计并合成的含有i N O S 特异性s h R N A 的p G e n e s i l 1 质粒转染入舌鳞癌T e a l13 细胞株，同时设阴性对照和空白对照。流式细胞仪和M T T 法分别检测T c a l l 3 细胞的凋亡率和生长曲线的变化情况。免疫组化检测细胞巾i N O S 的蛋白表达的改变情况。结果发现在脂质体介导的含i N O S 特异性s h R N A 的质粒转染入舌鳞癌细胞后，实验组T c a 8 1 1 3 细胞中i N O S 蛋白表达显著低于两对照组：而且实验组细胞V中山大学硕士论文R N A 干扰i N O S 基因对舌鳞龆
9、细胞增贿活性及V E G F 表达抑制的实验研究的凋亡率也明显高于其它两组( 尸 0 ，0 5结果显示实验组( P s i l e n c e r i N O S 组) 的肿瘤细胞凋亡率与阴性对照组( P s i l e n c e r H K 组) 、空白对照组之间均有统计学意义( P 0 0 5 ) 。说明R N A i 降低i N O S 基因的表达，使肿瘤细胞的凋亡有所增加。3 P s i l e n c e r - i N O S 对T e a 8 1 1 3 细胞的生长抑制实验组、阴性对照组、空白刘照组三组细胞根据吸光度O D 值绘制出生长曲线( 见附图1 罐1 。从图可见实验组T
10、 c a 8 11 3 细胞的增殖活性受到明显抑制。而两对照组细胞问的增殖则无明显差异。中山大学硕士论文R N A 干扰i N O S 基因对舌鳞癌细胞增殖活性及V E G F 表达抑制的实验研究讨论1 原有基因敲除方法的不足基因治疗是指通过操作人类本身的或者外源的遗传物质( D N A 或R N A ) 来干预疾病的发生、发展和进程，包括纠正人自身基因结构或功能上的错乱，杀灭病变细胞或增强机体清除病变细胞的能力等，从而达到治疗疾病的目的。现有的基因治疗手段主要包括：基因增补、基因替换、基因修复、基因敲除、免疫调节，以及肿瘤的自杀基因治疗等等。在这其中基因敲除是指通过各种方式，抑制或沉默癌基因
11、或有促瘤作用的基因的过高表达。原有的基因敲除方法涵盖了反义R N A 、反义D N A 、核酶、以及后续衍生的肽核酸、锁核酸等寡核苷酸链。但每种方法都有不足之处。反义R N A 特异性差，与靶基因链的亲和力差，常常需要化学修饰。且有一定的生物毒性：运用反义D N A 进行反基因治疗时对所需靶基因的要求很高，生物体内基因链很少能达到其要求；核酶则需依赖重组载体在体内表达发挥作用，这在一定程度上会限制其的药学作用。肽核酸的疏水性强，水溶性差，不易穿过细胞膜，难以被细胞吸收；而锁核酸的合成价格过高同样也制约它们的临床应用。2 R N A i 技术在肿瘤基因治疗中的应用R N A i 是一种由双链R
12、N A ( d s R N A ) 抑制细胞内源性基因表达的现象。是动植物生物体内普遍存在的一种现象，是生物体在进化上的一种保守的基因组水平的免疫监控机制。自从1 9 9 8 年F i r e 旺9 1 在对线虫的研究中偶然发现R N A i 这一现象以来，R N A 干扰技术作为一种新的分子医学研究的手段，很快就成为众多学者进行反向遗传学研究的一种行之有效的分子生物学工具之一。R N A i 技术有以下主要特点：高稳定性。以37 端悬垂T T 碱基的d s R N A 尤为稳定，无需像反义核酸那样进行广泛化学修饰；高效率性。R N A i 基因抑制效果确切，微量的s i R N A 即可使其
13、编码致病基因产物的含量下降9 0 以上：达到基因剔降( k n o c kd o w n ) 的效果；在本实验中，免疫组化的结果显示，实验组细胞的i N O S 的蛋白表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组。这说明R NA i 能有效地抑制目的基因的表达：高特异性。R N A i 具有严格的序列特异性，它的识别功能可以精确到一个核昔酸，即使一个碱基的错配，也会严重影响抑制效果，故治疗的针对性强，副作用小。本实验中阴性对照组和空白对照细胞之间凋亡率和生长曲线则无显著差异，而实验中山大学颁士论文R N A 干扰i N O S 基因对舌鳞痛细胞增艏活性及V E G F 表达抑制的实验研究组与两对照组
14、间均有明显差异。说明R N A i 具有特异性；可遗传性。初期的实验观察到，细胞增殖5 0 1 0 0 倍仍可保持R N A i 效应。这说明R N A i 可在体内诱导稳定遗传；合成简便。许多公司可以按照研究者的要求提供s i R N A 的专业设计、合成，而研究者仅需提供所需的靶基因名称或基因号。我们实验所用的含特异性s h R N A 质粒表达载体也是由专业公司构建的，这也为我们在进行本实验的研究中节省了大量的时问和精力。目前实现R N A i 的方法主要有以下5 种：1 ) 化学合成一是最贵但最方便的方法。主要的缺点包括价格高，定制周期长。最适用于已经找到最有效f f , J s i
15、R N A的情况F ，需要大量s i R N A 进行研究。2 ) 体外转录一一成本低、周期短。而且此方法得到的s i R N A s 只要较低的浓度就可以达到化学合成s i R N A s 较高浓度得到的效果。不足之处是实验的规模受到限制，而且体外合成s h R N A 的基因抑制持久性通常仅有5 7 天，需要不断导入s h R N A ，相对麻烦。最适用于筛选s i R N A s ，特别是需要制备多；种s i R N A s ，化学合成的价格成为障碍时。但不适用于实验需要大量的，一个特定的s j R N A 的 丈期研究。3 ) 长双链R N A 消化制备法一一这个方法通常是选择2 0
16、0 1 0 0 0 个碱基的靶, m R N A 为模版，用体外转录的方法制备长片断双链d s R N A ，然后用R N a s e1 1 1 ( o rD i c e r ) 在体外消化，得到一种s i R N A s “混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化f 1 7 , J d s R N A 后，这个s i R N A 混合物就 以直接转染细胞，具体操作方法和单一f f q s i R N A 转染方法一样。由于s i R N A 混合物中有许多0 i 同的s i R N A s ，通常能够保证目的基因被有效地抑制。主要优点在于可以跳过检测和筛选有效s i R N A 序列的步骤，不过有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的耩因。最适用于快速而经济地研究某个基冈功能缺失的表型。但不适用于长时间的研究项目，或者足需要一个特定的s i R N A 进行研究，特别是基因治疗。前面的3 种方法主要都是体外制备s i R N A s ，并且需要专门的R N A 转染试剂将s i R N A s 转到细胞内。而采用s i R N A
