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1、上海交通大学硕士学位论文CD11c髓样树突状细胞在慢性乙型 肝炎患者中数量和功能 的变化姓名：朱文静申请学位级别：硕士专业：内科学（传染病学）指导教师：谢青20080501上海交通大学医学院 2005 级硕士研究生学位论文 CD11cCD11c+ +髓样树突状细胞在慢性乙型肝炎患者中数量和功能的变化 摘 要 髓样树突状细胞在慢性乙型肝炎患者中数量和功能的变化 摘 要 背景背景 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是目前全球公共性问题， 严重危害人民健康。 既往研究表明慢性乙型肝炎 （chronic hepatitis B， CHB） 患者不能产生多克隆特异性辅助性T细
2、胞1 （T helper cell 1， Th1）和细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）反应，导致乙肝病毒不能被清除而形成长期感染。树突状细胞（dendritic cell，DC）作为专职抗原递呈细胞， 在诱导特异T细胞反应中起非常重要的作用。 多数研究认为，慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的免疫调节和抗原提呈功能存在表型、功能及细胞亚群比例等方面的异常，并且与HBV慢性持续感染密切相关。以往DC的研究多采用外周血单个核细胞体外诱导培养， 然而单核细胞来源树突状细胞(monocyte-derived dendritic cells, moDC)在长期
3、外源性刺激因子作用下有可能改变DC本身的免疫应答。根据DC的来源和表面标记以及功能，可将DC分为髓样树突状细胞(myeloid dendritic cell，mDC)和淋巴系来源的浆样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）。其中mDC前体即CD11c+髓样树突状细胞(CD11c+mDC) 主要发挥抗原提呈的功能，促进Thl细胞极化和细胞免疫的发生，相对moDC更能体现出树突状细胞的免疫监视作用，在HBV感染慢性化机制中可能起着更重要作用。本研究探讨慢性乙型肝炎患者外周血中CD11c+髓样树突状细胞数量、表型和功能的变化，并且结合患者病毒载量、血清转氨酶以及
4、肝脏炎症及纤维化程度等各项临床指标进行上海交通大学医学院 2005 级硕士研究生学位论文 分析，进一步阐明HBV感染临床慢性化的免疫机制。 目的目的 本研究探讨慢性乙型肝炎患者外周血中CD11c+髓样树突状细胞(mDC)数量、表型和功能的变化，以及与HBV持续感染之间的关系。 方法方法 用淋巴细胞分离液分离获取外周血单个核细胞 （PBMC） ， 标记FITC(CD3、 CD14、 CD16、 CD19、 CD20、 CD56)、 PE-CD11c+和APC-HLA DR单克隆抗体， 流式细胞仪检测mDC(CD11c+和HLA DR双阳性细胞) 在PBMC中的频数； 用BDCA-1树突状细胞分选
5、试剂盒从外周血单个核细胞中分离得到较高纯度的CD11c+ mDC，流式细胞仪检测新鲜分离mDC表面共刺激分子CD80、CD86表达；1.5105 mDC在RPMI1640中培养，同时加入人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF） 、干扰素-、聚肌苷酸胞苷酸(PolyI:C)刺激mDC成熟，24小时后收集细胞上清液，检测细胞上清液中白介素-12（IL-12）浓度； 以mDC为刺激细胞，CD4+ T细胞分离试剂盒分离外周血T细胞作为反应细胞， 进行同种异体混合淋巴细胞反应（MLR），检测mDC对同种异体T淋巴细胞的增殖能力。 结果结果 与健康对照组相比， 慢性乙肝患者CD11c+mDC占外周血
6、单个核细胞（PBMC）的频数明显降低，差异有统计学意义（0.43%0.55% vs. 0.77%0.56%, p0.05） ，见图 1-6。根据肝组织病理活检纤维化程度分为两组，Ishak 纤维化评分2（13 例），2（15 例），两组 mDC 频数分别为（0.610.72）%， （0.180.43）%，两组差异无统计学意义（p =0.061） 。慢性乙型肝炎患者不同炎症程度、不同纤维化分期 CD11c+mDC 均数频数比较见表 1-5。 表表 1-5. 慢性乙型肝炎患者不同炎症程度、不同纤维化分期慢性乙型肝炎患者不同炎症程度、不同纤维化分期 CD11c+mDC 频数比较频数比较 炎症程度炎症
7、程度 纤维化分期纤维化分期 无/极轻度炎症 轻度炎症 中度炎症 Ishak2 ULN1-2 ULNm DC(% )/无 极轻度炎症组无 极轻度炎症组轻度炎症组轻度炎症组中度炎症组中度炎症组0.000.250.500.751.001.25aamDC(%)59 图3 图3 mDC频数. A: 不同血清ALT水平组; B: 不同肝脏病理炎症程度组。aP0.05。 6.87%8.15%，45.26%21.54%，健康对照组CD80和CD86表达率为2.35%2.72%，18.71%10.93%，慢性乙肝患者组CD86表达率高于健康对照组（P0.05） ，而两组CD80表达率比较差异无统计学意义（图4）
8、 。 图 4 图 4 新鲜分离 CD11c+ mDC 细胞表型比较 3 讨论讨论 DC是功能强大的抗原递呈细胞，在诱导特异T细胞反应中起非常重要的作用2-3。 近几年，国内外诸多文献报道慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞数量、表型及功能均存在异常4-6。最近，Tavakoli等7提出不同看法，既往研究多以单核细胞来源的DC在细胞因子的刺激下长时间体外培养，因此DC本身的免疫应答会发生改变。将外周血DCs的前体细胞CD11c+ mDC和CD123+浆样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）分选研究可能有助于进一步阐明不同DC亚群在机体免疫中的不同作用及与慢性乙
9、型肝炎持续化感染的关系。mDC主要发挥抗原提呈功能，促进Th1细胞极化上海交通大学医学院 2005 级硕士研究生学位论文 59 2.4 新鲜分离CD11c+ mDC细胞表型比较 流式细胞仪技术检测新鲜分离纯化后的CD11c+ mDC表面共刺激分子，慢性乙肝患者组CD80和CD86表达率分别为6.87%8.15%，45.26%21.54%，健康对照组CD80和CD86表达率为2.35%2.72%，18.71%10.93%，慢性乙肝患者组CD86表达率高于健康对照组（P0.05） ，而两组CD80表达率比较差异无统计学意义（图4） 。 图 4 图 4 新鲜分离 CD11c+ mDC 细胞表型比较
10、3 讨论讨论 DC是功能强大的抗原递呈细胞，在诱导特异T细胞反应中起非常重要的作用2-3。 近几年，国内外诸多文献报道慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞数量、表型及功能均存在异常4-6。最近，Tavakoli等7提出不同看法，既往研究多以单核细胞来源的DC在细胞因子的刺激下长时间体外培养，因此DC本身的免疫应答会发生改变。将外周血DCs的前体细胞CD11c+ mDC和CD123+浆样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）分选研究可能有助于进一步阐明不同DC亚群在机体免疫中的不同作用及与慢性乙型肝炎持续化感染的关系。 mDC主要发挥抗原提呈功能，促进Th1细胞
11、极化0510152025303540455055patientscontrolsaCD80 CD86%CD80,CD86上海交通大学医学院 2005 级硕士研究生学位论文 60 和细胞免疫的发生8 。pDC是机体内源性I型干扰素（I-IFN）产生的主要细胞，I-IFN不仅对病毒复制产生直接抑制作用，还能激活NK细胞、B细胞、T细胞和mDC细胞，从而诱导并增强抗病毒的免疫应答8-9。 有报道在慢乙肝患者单核细胞来源的DC内发现病毒颗粒和HBV复制中间物， 而mDC和pDC细胞内却仅能检测到HBV DNA， HBV RNA复制中间体及共价闭合环状DNA(covalently closed circ
12、ular DNA, cccDNA)却不存在，这提示HBV病毒在mDC和pDC内不能核转录和复制7,10。因而，对mDC和pDC分离研究可能会完善以往我们对树突状细胞缺陷引起免疫耐受的新认识。 由于慢性乙型肝炎为HBV病毒感染诱发的免疫相关性疾病，HBV病毒对免疫细胞的感染影响着宿主的免疫功能。但慢性乙型肝炎病毒持续感染状态下，外周血中DCs数量是否也同样存在缺陷，目前研究结论不一7,11,12。若单纯比较DCs亚群数量变化意义不大，但本实验结合患者转氨酶水平、血清病毒载量及肝脏炎症程度等综合指标来探讨临床现象与免疫研究之间的相关性。实验结果显示：慢性乙型肝炎患者外周血mDC亚群比例下降，可能与
13、下列因素有关：(1)HBV直接感染mDC，诱导其凋亡，导致DC数量下降。本实验中发现慢性乙型肝炎患者外周血mDC频数与血清HBV病毒载量呈明显负相关，临床上我们认为病毒载量是肝脏损害加剧的最大危险因素，HBV复制的直接指标为HBV DNA水平, HBV DNA水平高低与机体免疫功能相关13 (2)mDC参与机体免疫活动而转移到炎症部位或其他靶器官等14。本实验中慢性乙型肝炎患者外周血mDC频率与血清ALT水平存在负相关，且ALT2ULN的慢乙肝患者外周血mDC频率明显低于ALT正常患者。进一步根据肝脏组织学病理结果，将不同程度肝脏炎症等级慢性乙型肝炎患者mDC相对数量作比较，发现轻度炎症组和中
14、度炎症组mDC相对百分数均低于无炎症和极轻度炎症组。 这间接提示外周血中感染HBV病毒的DC，激活后向肝脏炎症部位趋化，从而使外周循环DC数量减少，加之病毒诱导DC功能的缺陷，机体无法产生强大而特异性的CTL反应。最近也有研究发现在HBV感染免疫激活期循环中的DCs亚群数量减少，而浸润至肝脏的DCs有所增加，肝脏DCs数量与血清ALT水平呈正相关12。 CD80（B7-1） 、CD86（B7-2）与T细胞表面CD28的结合为T细胞激活提供第二信号，形成强烈的共刺激信号后，活化CTL等免疫活性细胞以清除病毒。以往研究上海交通大学医学院 2005 级硕士研究生学位论文 61 中从外周血中分离PBM
15、C在体外经细胞因子刺激诱导10-14d，健康对照者DC表面共刺激分子CD80、CD86表达率可达到80%-90%，而慢性乙型肝炎患者仅30%-40%，DC表型成熟存在障碍15。本研究与以往不同，直接对CD11c+ mDC分离纯化，通过检测未经刺激DC细胞表型反映其外周血中活化状态。实验结果显示正常对照与患者组CD11c+ mDC表面共刺激分子CD80、CD86表达率均低下，说明循环中DC绝大部分为未成熟DC，这与之前Kunitani等16研究结果一致。患者组CD86表达率稍高于正常对照组，原因可能是慢乙肝患者外周血中mDC吞噬HBV病毒颗粒后加工递呈抗原，迁移至淋巴组织成为成熟mDC，同时表面
16、共刺激分子表达增加，在这个动态的过程中，可能会检测到外周血中mDC的CD86表达升高。同时也提示，慢性乙型肝炎患者外周血mDC在受到病毒抗原刺激后形成共刺激信号的能力并未受明显影响。 DC 作为体内免疫反应的始动子、调节子和效应子，一旦受损会影响到机体免疫的各个环节。本研究表明， 慢性乙型肝炎患者中 CD11c+mDC 数量减少可能与病毒作用及肝脏炎症相关，CD11c+mDC 数量减少是导致机体无法产生强大特异性 CTL反应的原因之一，但细胞表面共刺激能力并无缺陷，今后我们将对 CD11c+mDC 细胞亚群的功能状态作进一步深入研究， 这对于探讨 HBV 持续感染的免疫机制及未来制备高效的 DCs 疫苗运用于临床治疗具有重要意义。 4 参考文献参考文献 1. Osu
