《S100A4与MMP9在喉鳞癌中的表达及相关性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《S100A4与MMP9在喉鳞癌中的表达及相关性研究（41页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、S1 0T h e中国医科大学研究生学位论文独创性声其1 Y 2 0 9 17 3 1 1 i - l删脚本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：主l 叁盔，日期：矽f2 ，。y f 厂中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权
2、的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：型垒查3指导教师签名：日期：目录一、摘要中文论著摘要1英文论著摘要5二、英文缩略语1 0三、论文前言材料和方法实验结果讨论结论四、本研究创新性的自我评价五、参考文献六、附录。综述在学期间科研成绩致谢个人简介中文论著摘要
3、S 1 0 0 A 4 与M M P 9 在喉鳞癌中的表达及相关性研究莉置喉癌是头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，在我国，东北地区是喉癌的高发区。过去的1 0 年中，我国喉癌的发病率呈现上升的趋势。喉癌对放疗及化疗均不敏感，手术是目前治疗的主要手段，但其局部浸润和转移对临床治疗和预后有着重要影响，是造成喉癌患者治疗失败和死亡的主要原因，而肿瘤侵袭和转移是一个多步骤、多阶段、多途径、涉及多基因变化的一系列复杂过程，包括肿瘤细胞从原发灶脱落，与基底膜粘着，产生蛋白酶降解细胞外基质，侵入血管或淋巴管，诱导肿瘤血管形成，最终在远处形成转移灶。因此探讨与喉癌转移相关的基因对喉癌的治疗和预后具有重要意义。
4、S 1 0 0 家族蛋白属于钙离子结合蛋白，在分子结构具有高度同源性，它们有共同的E F 双螺旋结构的氨基酸基序( 手型钙离子结合区) ，这一基序能够促进其与钙离子高度结合，参与信号转导通路从而调节细胞的生长和分化。作为$ 1 0 0 蛋白家族成员，S 1 0 0 A 4 蛋白通过与钙离子结合在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。人类$ 1 0 0 A 4 基因定位于l q 2 1 ，编码由1 0 1 个氨基酸组成的多肽，分子量约为1 1 7 k D a 。S 1 0 0 A 4 参与调节多种细胞内外功能，如细胞生长和新陈代谢，影响细胞骨架形成、改变细胞形状、参与信号传导，调节细胞黏附等。S 1 0
5、 0 A 4 可作为一种重要的肿瘤调节因子发挥生物学作用，并且与肿瘤细胞侵袭和转移密切相关。研究报道在多种肿瘤组织中S 1 0 0 A 4 表达升高，如食管癌、胃癌、结肠癌及黑色素瘤等，近来研究发现在乳腺癌中上调$ 1 0 0 A 4 的表达后促进肿瘤细胞转移，而且S 1 0 0 A 4 阳性表达的乳腺癌患者预后很差。但$ 1 0 0 A 4 参与肿瘤发生和转移的机制仍不十分清楚。基质金属蛋白酶类( M a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s ，M M P s ) 是一组锌离子依赖性肽链内切酶，M M P s 激活后能够促进肿瘤生长，侵袭和转移
6、，其家族包括2 1 种以上的蛋白酶。其中，M M P 9 作为一种9 2 K D A 的明胶酶，于1 9 8 9 年首次从人纤维母细胞克隆出来，人M M P 9 基因位于染色体2 0 q 1 1 1 1 3 1 。当它激活后能够使胶原蛋白结构发生变形并将其降解，它通过降解细胞外基质和基底膜，从而促进肿瘤侵袭和转移。在正常肺组织中M M P 9 极少表达，但是在肺部疾病，如哮喘，肺纤维化，C O P D 中高表达，亦有研究发现在乳腺癌，结直肠腺瘤和胃癌中M M P 9的表达均比相应的正常组织中增高。它也是作为一种肿瘤促进因子发挥生物学功能。最近有研究发现在前列腺癌P C 3 细胞系中转染S 1
7、0 0 A 4 的表达载体后能够在蛋白水平和m R N A 水平上上调M M P 9 的表达。所以我们推测在喉癌中S 1 0 0 A 4可能调节M M P 9 的表达。两者可能在喉的发生发展及淋巴结转移过程中起协同作用。但上述假设是否成立? 其具体机制如何? 这些问题需要我们进一步研究证实。本研究目的旨在探讨喉组织中S 1 0 0 A 4 和M M P 9 的表达情况及与临床病理学参数的意义。在细胞水平上，通过干扰S 1 0 0 A 4 ，观察其对M M P 9 表达的影响。材料与方法一、材料1 1 5 例喉组织标本( 3 5 例癌旁喉组织和8 0 例喉鳞癌组织) ，均来自中国医科大学附属第一
8、临床学院2 0 0 9 2 0 1 1 年耳鼻咽喉头颈外科手术切除的标本，所有患者均为原发，术前均未接受放、化疗。标本经H E 常规染色后由两名病理医师明确诊断。其中部分癌旁喉组织( 远离肿瘤至少1 厘米) 和癌组织离体后立即放入液氮后7 0 。C 冰箱保存，以备W e s t e r nb l o t 检测。1 株喉癌癌细胞株( H e p 2 ) ，用含1 0 新鲜胎牛血清的D M E M 培养基，在3 7 ，5 C 0 2 的条件下培养。二、主要试剂和来源S 1 0 0 A 4 兔单克隆抗体，S 1 0 0 A 4s i R N A ，M M P 9 羊单克隆抗体均购自美国S a n t
9、 aC r u z 公司。H i p e r f e c t 转染试剂购自Q I A G E N 生物公司。S P 免疫组化试剂盒、D A B 酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。三、方法l 、免疫组织化学染色及结果判定2标本用中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成4 t t m 连续切片，采用链菌素抗生物素蛋白过氧化物酶免疫组化法( S P 法) 检测S 1 0 0 A 4 和M M P 9 蛋白表达。以P B S 缓冲液代替一抗为阴性对照。结果判定：S 1 0 0 A 4 和M M P 9 蛋白以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。高倍视野( x 4 0 0 ) 下选阳性信号最强区域
10、计数2 0 0 个肿瘤细胞中阳性细胞数，按S 1 0 0 A 4 和M M P 9 蛋白表达百分率分为以下四个等级：0 为0 分，1 5 0 为1 分，5 1 7 5 为2 分， 7 5 为3 分。根据染色强度分为三个等级：浅黄色计为1 分，棕黄色计为2 分，黄褐色计为3 分。以阳性细胞率和染色强度的分值乘积作为每一例的积分，积分 4 为阳性。2 、W e s t e r nB l o t在收集的细胞内加入裂解液充分裂解，低温高速离心( 4 ，1 5 0 0 0 转m i n ，3 0 m i a ) ，提取上清为总蛋白。上样蛋白量为6 0 t t g 。电泳( 1 0 S D S - P A
11、 G E 凝胶) 、转印至P V D F 膜、封闭，一抗S 1 0 0 A 4 ( 1 ：2 0 0 ) 、M M P 9 ( 1 ：2 0 0 ) 和p - a c t i n ( 1 ：2 0 0 ) ，4 。C 孵育过夜，分别与各自对应的二抗( 1 ：4 0 0 0 ) 室温孵育2 小时，E C L 显色，结果经自动凝胶成像分析仪采集，进行灰度值测定，f l - a c t i n 做内参。3 、s i R N A 干扰实验分三组：空白对照组、非特异性s i R N A 转染组和特异性s i R N A 转染组，每个实验均重复三次，转染具体步骤按H i p e r f e c t 试剂说
12、明书进行。四、统计分析应用S P S S1 3 0 统计软件进行数据处理，采用# 检验分析各组计数资料，采用S p e a r m a n 等级相关分析S 1 0 0 A 4 蛋白与M M P 9 蛋白表达的关系，采用t 检验分析W e s t e mb l o t 图像灰度值，组化积分值，P 21h u m a np r o t e a s e s A m o n gt h e m ，M M P - 9i sa l s ok n o w na st h e9 2 k D at y p eI Vc o l l a g e n a s e g e l a t i n a s e ，M M P -
13、 9e D N AW a sf i r s tc l o n e di n19 8 9f r o mt r a n s f o r m e dh u m a nf i b r o b l a s t s ，t h eM M P - 9g e n ei So nh u m a nc h r o m o s o m e2 0 q 1 1 1 - 1 3 1 ，w h i c ha f t e ra c t i v a t i o n , C a nd e g r a d et y p eI Vc o l l a g e na n dd e n a t u r e dc o l l a g e n
14、s M M P 9C a nd e g r a d ec e l l - m a t r i xa t t a c h m e n t sa n db a s e m e n tm e m b r a n e s ，w h i c hi so f t e nt h ei n i t i a ls t e pi nc a r c i n o m ai n v a s i o n M M P 一9i sp r e s e n ti nl o wq u a n t i t i e si nt h eh e a l t h ya d u l tl u n g ，b u tm u c hm o r ea
15、 b u n d a n ti ns e v e r a ll u n gd i s e a s e s ，i n c l u d i n ga s t h m a , i d i o p a t h i cp u l m o n a r yf i b r o s i s ( I P F ) ，a n dc h r o n i co b s t r u c t i v ep u l m o n a r yd i s e a s e ( C O P D ) T h et u m o rt i s s u el e v e l so fM M P - 9a r ee l e v a t e dc o m p a r e d谢mt h ec o r r e s p o n d i n gn o r m a lt i s s u ei nav a r i e t yo fc a n c e rD f p c s ，i n c l u d i n gb r e a s t ,c
