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1、二甲双胍通过激活A M P K 减轻高脂燃导的 肥胖C 5 7 B L 6 J 小鼠肾脏损伤M e t f o r m i na l l e v i a t e sr e n a li n j u r yi nC 5 7 B L 6 Jm i c et r e a t e dw i t hh i g hf a td i e tb ya c t i v a t i n gr e n a lA M P K论文课题起止时间：至Q ! Q 生2 旦= 2Q ! 至生圣月论文完成时间：2Q 12 生圣旦中国医科大学( 辽宁)20 12 年4 月中国医科大学研究生学位论文独创性声明丫l l l l z I
2、 f I t u I l l 9 l l l H 2 I I f 。l l H I 9 I H I 4 l I t t本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文储料：牝魄畔趟中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻
3、读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：、孚赵幺鎏 指导教师签名：越面日期：中文论著摘要l英文论著摘要4二、英文缩略语8三、论文前言“9甘青“一“一”9材料与方法1 0实验结果0 00 0Q0 000 10 1 7讨论0QO OO 0 0 000 QO QO 2 3结论”O m
4、O0 00 0 0 00QOQ gg 2 6四、本研究创新性的自我评价2 7五、参考文献BO gOO ODOOgg g 2 8六、附录综述”3 2在学期间科研成绩0i OOO O0000 4 3致谢”Q O OQ 0 0 4 4个人简介9 0 00 0 0 4 5中文论著摘要二甲双胍通过激活A M P K 减轻高脂饮食诱导的肥胖C 5 7 B L 6 J 小鼠肾脏损伤吉j r 吉莉昌越来越多的证据表明肥胖、代谢综合征( M S ) 与白蛋白尿以及慢性肾脏病密切相关。肥胖时存在几种病理生理紊乱：炎症、氧化应激、脂肪因子改变、胰岛素抵抗、肾素血管紧张素醛固酮系统激活、巨噬细胞表型转换以及肾脏局部脂
5、代谢异常，都能促进肾脏损伤。研究显示在肝脏、肌肉组织以及某些细胞系，持续活化A M P 激活的蛋白激酶( A M P K ) 可以减少组织细胞中脂质沉积，减轻炎症及氧化损伤。有研究报道，二甲双胍可通过激活肝脏以及肌肉中A M P K ，改善胰岛素抵抗。由此，我们推测二甲双胍可能通过激活肾脏A M P K 减轻高脂饮食诱导的肥胖小鼠肾脏损伤。目的观察高脂饮食C 5 7 B L 6 J 小鼠肾脏A M P K 活性的变化及二甲双胍对高脂饮食诱导的肾脏损伤的改善作用。方法6 周龄的雄性C 5 7 B L 6 J 小鼠3 2 只，随机分为2 组：普通饮食组( N D ) ，给予基础饲料喂养( 1 5
6、能量由脂肪提供，n - 8 ) ；高脂饮食组( H F D ) ，给予高脂饲料喂养( 5 9 能量由脂肪提供，n = 2 4 ) 。8 周后根据体重将达到肥胖标准的H F D 小鼠选出1 6 只随机分成2 组：高脂饮食组，继续给予高脂饮食( n _ 8 ) ；二甲双胍干预组( M ) ，给予高脂饮食和二甲双胍( 7 5 m g k g q d 1 ) 灌胃( n _ 8 ) 。继续喂养4周，应用体重及血生化指标对模型进行评价；F o l c h 法提取肾脏脂质，酶法检测：光镜观察肾脏组织结构变化；R e a lt i m e P C R 检测肾皮质固醇调节元件结合蛋白( S R E B P )
7、 1 e 、过氧化物酶体增殖物激活受体l r 辅激活子( P G C ) 1 a 、肿瘤坏死因子( n 师) 吨、N A D P H 氧化酶( N O X ) 4m R N A 表达；W e s t e r nb l o t 法检测肾脏p - A M P K a 蛋白表达；对数据进行单因素方差分析及相关性分析。圣士里二口7 R1 、与N D 组相比，H F D 组小鼠体重( B W ) 明显增加( 2 5 4 4 士0 6 8 9V S3 2 7 5 + 1 6 9 9 ，P 0 0 5 ) 。与H F D 组相比，M 组经二甲双胍干预后小鼠肾皮质p - A M P K a 蛋白表达增加( O
8、 1 1 士0 0 6V S0 2 1 i - 0 0 6 ，P o 0 5 ) ，P G C 1 am R N A 表达下降1 5 3 ，差异无统计学意义( P o 0 5 ) 。与N D 组比较，H F D 组小鼠肾皮质T N F - o , 、N O X 4m R N A 表达升高分别为1 3 3 7 、9 6 6 ，差异有统计学意义( 分别为：P 3 2 7 x 1 0 6 m 3 ) 伴或不伴局灶性阶段性肾小球硬化【1 4 1 。本实验显示，高脂喂养的小鼠除表现出中心性肥胖外，还伴有血T G 升高、H D L 降低以及胰岛素敏感性下降的代谢综合征状态，但空腹血糖及血胆固醇未见明显升高
9、，这与人类肥胖患者代谢紊乱相似。尿蛋白较普通饮食组明显增加，H E 、M a s s o n 染色显示肾小球肥大、系膜细胞及系膜基质增生，类似人类肥胖相关性肾病临床及病理改变。二、高脂饮食诱导小鼠肾脏过多中性脂肪沉积非脂肪组织中过多的脂质积聚会导致脂毒性，引起细胞机能障碍、细胞凋亡阴。细胞脂质的平衡的调节包括脂质的流入、流出、合成及代谢，这些过程的失平衡会导致巨噬细胞、系膜细胞、血管平滑肌细胞转变成泡沫细胞1 5 】。与其他研究【4 羽一致，本实验结果显示，高脂饮食组小鼠肾小球及小管有过多的中性脂肪沉积。定量检测显示肾皮质甘油三酯含量明显增加，而胆固醇含量未见明显改变。许多关于肥胖及代谢综合征
10、模型的研究【5 “1 6 1 发现，在肾脏局部参与脂质合成的因子S R E B P s 及其下游酶类表达增加。J i a n g 等 5 】用高脂喂养s I 冱B P 1 ，小鼠，与野生型相比，甘油三酯在肾脏的沉积被阻止及有关肾脏损伤的因子( 血管内皮生长因子、纤溶酶原激活抑制因子1 等) 表达也明显减少。说明S R E B P I c 在高脂诱导的肾脏损伤中起到重要作用。而本实验结果并没有观察到高脂饮食组小鼠肾脏S R E B P 1 cm R N A 表达上调。同样，w a d a + 1 刀用高脂高果糖诱导的小鼠脂肪肝模型，肝脏S R E B P 1 c 表达也没有明显变化，而这可能与S
11、 R E B P 1 c 启动子区基因多态性有关。S R E B P 1 c 作为参与脂质合成的关键因子之一，本实验用高脂饮食并没有诱导其升高，而H F D 组小鼠肾脏甘油三酯含量较N D 组明显升高，因此我们认为S R E B P 1 c 表达的变化可能不参与高脂诱导的肥胖小鼠肾脏过多的脂质沉积。有研究报道【1 7 , 1 5 ，高脂饮食诱导的过氧化物酶体增殖物激活受体丫共激活子( p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r - a e t i v a t e dr e c e p t o r q , c o a c t i v a t o r ，P
12、 C - C ) 1 家族( 包括P G C - l a 和P G C 一11 3 ) ，可协同增强S R E B P 1 c 介导的脂质合成酶类的上调。本实验结果显示，I - I F D 组肾皮质P G C 1 am R N A 表达蜘组明显上调。提示P G C 1 可能参与高脂饮食诱导的肥胖小鼠肾脏过多脂质的积聚。三、高脂饮食诱导小鼠肾脏氧化应激及炎症反应本实验显示高脂饮食可诱导小鼠肾脏N A D P H 氧化酶( N A D P HO x i d a s e ，N O X )4m R N A 表达明显升高。N O X 4 是近年发现的一种非巨噬细胞N A D P H 氧化酶，在肾脏高表达
13、f 1 9 1 。S h a r m a 等0 9 1 研究指出，脂联素缺陷可以导致肾脏以及足细胞N O X 4 蛋白表达上调，从而提供了另外一个联系肥胖、胰岛素抵抗和氧化应激的重要纽带。内脏脂肪可以分泌生物活性物质，促进机体微炎症状态 2 0 l 。T N F 吨有致细胞凋亡及促炎症的特性，给大鼠输注n 师吨可加重白蛋白尿【2 n 。有研究【1 q 发现肥胖相关性肾病患者不仅肾小球T N F - 缸蛋白表达增加，而且m R N A 水平也明显升高，说明T N F a 在肥胖相关性肾病的发展中扮演重要角色。同时也提示，肾小球细胞本身可作为炎症环境的积极反应者，促进肾小球损伤1 1 6 】。我们
14、实验观察到高脂饮食的C 5 7 B U 6 J 小鼠肾皮质T N F am R N A 表达增加。以上提示氧化应激和炎症反应参与了高脂饮食诱导的肾脏损伤。四、高脂饮食诱导肾脏6 小心K 活性下调A M P K 被看作是一种超敏感的细胞能量感受器。其可通过刺激A T P 合成的途径和抑制御m 消耗途径来维持细胞能量的平衡。多个生物过程都受到6 山m K 的调节：细胞营养( 葡萄糖和脂肪酸) 的吸收、蛋白合成、基因转录、炎症等【8 】。在肥胖者体内，A M P K 的活性是下降、不变还是升高，研究结果并不一致 2 2 1 。A M P K 通路的研究在肾脏领域刚刚起步，新近研究发现A M P K
15、活性改变在肾脏离子转运、糖尿病肾病以及急性肾缺血损伤中发挥重要作用【8 1 。关于肥胖时肾脏A M P K 活性变化，国内外研究少有报道。与K u m e 【6 】研究一致，本实验结果显示，H F D 组小鼠肾脏A M P K 活性较L F D 组下降约5 2 ，提示长期高脂饮食可导致肾脏A M P K 活性下调。这种下调可能与机体脂联素水平的降低有关1 8 , 1 9 。五、二甲双胍上调肾脏6 山口K 活性，改善肾脏损伤在消耗A T P 的应激中，A M P K 可以将细胞合成代谢转变为分解代谢，维持细胞能量平衡。这使其成为许多药物治疗代谢紊乱的靶点，如某些抗糖尿病药物，这些药物可直接抑制线粒体A T P 合成，从而激活A M P K
