《神经生长因子对缺血缺氧诱导的大鼠小脑皮质神经细胞凋亡的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《神经生长因子对缺血缺氧诱导的大鼠小脑皮质神经细胞凋亡的影响（51页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、硕士学位论、文M A S T E RT H E S I S神经生长因子对缺血。缺氧诱导的大鼠 。一小脑皮质神经细胞凋亡的影响李、强一锦州、医学院缩写词表缩写英文全称中文伞称N G FR l l a s e5 F uL D HP I1 T U N E LN e r v eg r o w t hf a c t o r神经生长因子r i b o n u c l e a s e核糖核酸酶5 F l u o r o u5 一氟尿嘧啶L a c t a m i t ed e h y d r o g e n a s e乳酸脱氢酶P r o p i d i u mi o d i d e碘化丙啶t e r m
2、i n a ld e o x y n u c l e o t i d y l末端脱氧核甘酸t r a n s f e r a s em e d i a t e dd U T P b i o t i n 转移酶介导的d U T Pn i c ke n d l a b e l i n g缺口末端标记法D N DD e l a y e dn e u r o n a ld e g e n e r a t i o n 迟发性神经细胞退化中文摘要目的：利用大鼠全脑缺血实验和体外小脑皮质神经细胞培养方法，探讨神经生长因子对缺血缺氧后小脑皮质神经细胞凋亡的防治作用，为临床小脑缺血的治疗提供理论依据。方法：1
3、整体动物实验：采用闭塞大鼠四动脉法建立全脑缺血模型，应用光镜、电镜及末端转移酶介导的缺L 】末端标记法( T U N E L 染色法)观察模型组和N G F 治疗组动物脑缺血3 0 r a i n 再灌注7 d 小脑皮层神经细胞凋亡的情况。2 体外小脑皮质神经细胞培养实验：用原代培养的S D 大鼠乳鼠小脑皮质细胞，建立了缺氧缺糖诱导的神经细胞凋亡模型，实验组的各组提前2 4 h 加入N G F 。通过M T T 法测定细胞存活率和细胞代谢情况。检测培养液中L D H 含量，反映细胞的功能状态。通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。利用H E 染色法和T U N E L 染色法，通过光学显微镜观察细胞凋
4、亡情况。结果：1 动物整体实验：模型组小脑皮层神经细胞有明显形态学损伤，T U N E L 染色示小脑皮质蒲旨野细胞凋亡率为5 3 0 2 。而实验B 、C 组( N G F l 0 0 0 u k g ，2 0 0 0 u k g ) 神经细胞结构损伤明显减轻，凋亡细胞率分别为2 4 4 2 和2 1 9 2 ，较模型组明显减轻( P 0 0 5 “p 0 0 5 ) 。表6N G F 对神经细胞存活率的影响( )分组细胞存活率( )空白对照组模型组实验A 组实验B 组实验C 组1 0 05 6 6 6 7 5 7 1 2 5 4 ”8 3 6 7 8 ”8 2 8 1 0 1 4 “经单冈
5、素方差分析，组问q 检验，神经细胞存活率比较：_ L j 止常对照组比较P 0 0 5 ，”与模型对照组比较P 0 ，0 5 ，# 与模型对照组比较P 0 0 5 ，与模型对照组比较P 0 0 5 ，# 与模型对照组比较P 0 0 5 ，+ + 与模型对照组比较P o 0 5 ，# 与模型对照组比较P 0 0 5 ，与模型对照组比较P o 0 5 ，# 与模型对 c c 组比较P O 0 1空白组模型组实验A 组实验B 组实验C 组 圈7T I J N E L 染色神经细胞调亡事1 8加鼬们加加0 9 6 瓣U 器讨论1 缺血觖氧诱导大鼠小脑皮质神经细胞凋亡模型的建立在中枢神经系统中，海马、纹
6、状体、大脑和小脑皮层对缺_ 【f I L 较敏感，缺血后易发生迟发性神经元死亡( d e l a y e dn e u r o n a ld e a t h ，D N D ) 。近年来人量的研究表明，迟发性神经元死亡主要是是通过凋亡完成。N i t a t o r i t 9 1 等将沙土鼠双侧颈总动脉阻塞5 分钟后恢复正常血流，产生短暂前脑缺血，通过T U N E L 染色法观察到缺血再灌注后神经细胞凋亡情况，结果显示海马C A 区锥体细胞于缺血后第3 天标记出凋亡细胞，D N A 片段的凝胶电泳在第4 天呈梯状，电镜下出现染色质凝聚及凋亡小体，表明C A ，迟发性神经元死亡的形式主要为凋亡
7、。以后的大量实验均表明脑缺血后选择性神经元死亡的形式主要为凋亡。目前国内、外对脑缺血后神经细胞凋亡的研究热点集中在大脑皮层和海马上，对小脑皮层方砥的报道不多。小脑皮层对缺血也较敏感，尤其是小脑的蒲肯野细胞，在严重的全脑缺血后常发生小脑蒲肯野细胞选择性神经元死亡1 1 叭。许多啮赤类动物的脑缺血模型都可诱导可复制的蒲肯野细胞死亡I l l j 2 1 。S i e b e r I ”1 等的研究表明，狗不全脑缺血2 0分钟再灌注7 天后，约7 0 的小脑蒲肯野细胞出现损害表现，】8 的蒲肯野细胞脱失。同时他们还研究发现，狗不全脑缺廊2 0 分钟再灌注1 天时，小脑前叶神经细胞密度无呱显改变，再灌
8、注7 天后有5 9 1 6 的小脑前叶神经细胞出现缺血损害变化【1 4 1 。M a r t i nL J 副等的研究也证实了这一点，狗不全脑缺血后7 天时小脑蒲肯野细胞损伤的表现比1 天时明显。H a r a A f l 6l 等研究表明人全脑缺血后，通过原位末端标记法检测约1 3 的小脑颗粒细胞具有断裂的D N A 片段。丁是我们借鉴上述方法，采用大鼠全脑缺血模型观察发现，大鼠全脑缺血3 0 分钟冉灌注7 天后，小脑皮质神经细胞出现明显细胞损害表现。H E 染色显示小脑皮质神经细胞结构排列散乱，各层细胞均有脱失现象，以颗粒细胞和蒲肯野细胞尤为明显。T U N E L 染色显示小脑皮质各层细
9、胞均有凋亡发生，以蒲肯野细胞层最为明显，5 3 1 l 的蒲肯野细胞显示T U N E L 阳性标记。电镜结果鼹示小脑颗粒细胞出现染色质边集、密度增加、核变形、细胞体积缩小等细胞凋亡损害变化。实验结果与前人的研究基本符合。表明大鼠全脑缺血3 0 分钟再灌注7 天诱导小脑皮质神经细胞凋亡模型的建立是成功的。造成体外培养的细胞缺氧或缺氧复氧损伤的模型，目前大多采用持续通入0 9 5 0 2 、0 0 5 C 0 2 和0 9 5 N 2 、0 0 5 C 0 2 方法。本文根据S a l v a t e r r a f 8 l等报道的方法采用连二亚硫酸钠孱导小脑颗粒细胞缺氧损伤，应用此方法制作中枢
10、神经细胞缺氧或缺氧缺糖模型多建立在胎鼠大脑皮层神经细胞原代培养基础上，关于用此方法建立小脑皮质神经元缺氧缺糖损伤模型，国、内外尚未见报道。我们在预实验中发现，小脑皮质颗粒细胞对缺氧缺糖损伤有明显的耐受性。据报道1 1 7 J ，在培养液中加入终浓度为O 5 m m 0 1 L 1 的连二亚硫酸钠培养2 4 h 即造成培养的人脑皮质神经细胞明显损伤。但用在培养的小脑颗粒细胞上2 4 h 仍未见细胞明显损伤，继续培养至4 8 h ，才发现神经细胞出现明显损伤表现。倒置显微镜下观察神经元数量减少，细胞的树突、轴突缩短、减少或完全消失，部分细胞呈碎片状。同时据文献报道引，神经细胞在培养7 9 d时是敏
11、感而脆弱的，易受谷氨酸、缺氧等因素损伤，也易被药物保护。冈此本文根据S a l v a t e r r a l 8 1 等报道的方法加以改良，将培养7 d 的神经细胞换上含O 5 m m 0 1 L 。1 连二亚硫酸钠的E a r l e S 液培养4 8 h ，建立了体外培养的小脑颗粒细胞缺氧缺糖损伤模型。流式细胞仪检测凋亡细胞比率为4 7 T U N E L 染色发现有大量阳性细胞，M T T 法示细胞存活率明显下降，检测培养液中L D H 明显增高。此方法简便、易行、可复制，能够诱导培养的小脑颗粒细胞凋亡。2 N G F 对缺血缺氧诱导小脑皮质神经细胞凋亡的阻抑作用本文通过建立大鼠全脑缺
12、血再灌注模型和体外小脑颗粒细胞缺氧缺糖损伤模型，探讨了N G F 对小脑皮质细胞凋亡的保护作用。整体动物实验研究发现，给予外源性N G F 腹腔用药观察，实验B 、C 组( N G F l 0 0 0 u k g ，2 0 0 0 u k g ) 小脑皮质神经细胞损伤明显减轻，各层细 胞排列规则，细胞缺失不明显。蒲肯野细胞凋亡率分别为2 4 4 0 和2 1 9 2 ，均较模型组明显减少( P o 0 5 ) 。实验A 组( N G F l 0 0 u k g )组保护作用1 i 明显考虑与剂量过小，雉以达到局部有效药物浓度有关。由此利用形态学、免疫组织化学等手段证实，N G F 对大鼠全脑缺
13、血再灌注引起的小脑皮层神经细胞凋亡具有显著保护作用。体外小脑颗粒细胞培养实验结果显示：加入外源性N G F ( 5 0 ，l O O u g L ) 能明显减轻缺氧缺糖造成的小脑颗粒神经元形态损伤，明显降低培养液中L D H 活性，提高细胞存活率。由于L D H 存在于神经细胞内，所以在正常细胞培养液中其含量较低。而细胞损伤后，胞膜结构受到破坏，导致L D H 外漏，培养液中其含量增高，从而间接反映细胞损伤程度。实验结果显示实验B 、c 组L D H 含量较模型组明显降低，说明N G F 对细胞有保护作用。M T I “ 法检测细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的活力。琥珀酸脱氢酶( S D H ) 是
14、能量代谢中重要的酶，它存在于线粒体中。活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使外源性的M T T 还原为难溶性的蓝紫色结晶物( F o r m a z e n ) 甲躜。检测细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的活力在一定程度上反映了细胞的生存活力和线粒体的功能状态，反映J ，细胞代谢功能1 1 9 1 。实验结果显示，实验B 、c 组细胞琥珀酸脱氢酶的活力较模型组明显增高( P 0 0 1 ) 。经流式细胞仪分析模型对照组细胞凋亡率为4 7 0 8 ，而给予N G F 的实验B 组和C 组分别为17 0 9 、1 0 5 6 ，明显低于模型对照组( P o 0 5 ) 。n J N E L 染色亦显示N G F 组凋
15、亡细胞明显减少。表明给予外源性N G F ，能够抑制缺氧缺糖造成的小脑皮质神经细胞凋亡，对缺氧缺糖引起的小脑皮层神经细胞损伤有明甚保护作用。3 N G F 对缺血缺氧诱导小脑神经细胞凋亡的阻抑作用机制凋亡( A p o p t o s i s ) 或细胞程序性死7 一( P r o g r a m m e dc e l ld e a t h ) 是一种不同于细胞坏死m e c r o s i s ) 的死亡方式【2 0 l 。机体内环境的改变、外来毒素的作用及各种病理刺激因素等均可诱导细胞凋亡。许多神经退行性疾病如阿尔茨海默病( A l z h e i m e rd i s e a s e )
16、 、亨延钝病( H u n t i n g t o nd i s e a s e ) 及脑卒中等的发病过程中都存在细胞凋亡这1 病理机制1 2 1 22 1 。神经细胞凋亡存在于脑缺血性损伤中，这一发现有助于发现预防和治疗脑缺血性疾病的新方法，有助丁发现药物干预新的分子靶目标。甲- 在1 9 9 0 年S h i n g e n o1 2 3 1 等人报道沙土鼠大脑中动脉闭塞后海马C A ，区的N G F 含量减少，从而引起该区的迟发性神经元死亡。进一步的研究表明，在大脑中动脉闭塞前后分别在侧脑室注射N G F ，町以使D N D娃著减少。I s h i m a r u 等1 2 4 1 报道缺斑的人脑中内源性的N G F 缺乏町能造成胆碱能末梢的损伤，海马缺血后侧脑室注入N G F 可以延迟并预防胆碱能末梢损伤及预防D
