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1、择时电针对“阳虚”、“阴虚”大鼠创伤痛 其下丘脑F o s 蛋白表达的研究许建阳1王发强1 王梅康1文0 庆安1宋开源2 扬介宾2( 1 武警总医院，北京1 0 3 9 ，2 成都中医药大学)【摘要】目的：为了系统比较不同时展、不同机体状态，在镇痛方面的不同作用，并阐述其作用机制。方法：实验在“阳虚”、“阴庄”模型的基础上，进行截肢术造成创伤痛模型。电钟“太溪”和“足三里”，以免疫组化的方法检潮F o B 蛋白的表达。结果：不同时展电针对“阳虚”、“阴庄”大鼠创伤痛有一定的治疗作用和镇痛效应。电针可使其痛阙提高，电针可抑制创伤痛诱导的下丘脑F o s 蛋白的表达。其具有明显的昼夜节律性。基本探
2、明“阳虚”大鼠电针镇痛的最时机在卯时；“阴虚”则在酉子时，两者呈相互对应性。结论：择时针刺治疗痛症具有增强镇痛效应，为临床提供了重要的参考依据具有一定的理论和实际意义。【主曩词】电针钟刺镇痛；创伤痛痛阁；下丘脑；基因表达F o s 蛋白；昼夜节律单个余弦法肇始于五十年代末的针刺镇痛原理研究，经过国内外学者大量临床和基础方面的研究，已获得了丰富的针刺镇痛知识，而且取得了许多令人瞩目的成果。针刺镇痛效应。是由多种因素决定的。 2 】。其中机体状态和时间因索是非常重要而值得进一步探讨的问题。因针刺镇痛调整作用是以机体生理机能、病理变化为基础，而机体有着自身固有的生理、生化等节律。近年来随着时间生物学
3、的发展，掀起了对生物节律研究的高潮，目前对时间针法的研究做了大量的工作，但今尚无突破性进展。随着分子生物学的迅猛发展，开创了现代生物学的新时代。基因表达与疾病发生的关系是医学分子生物学研究的核心。原癌基因c 一属于在缺乏蛋白合成条件下，其m R N A 能被诱导的基因，由于刺激后的快速一过性表达，其的显示不仅可用于明确伤害性反应神经元，同时。也适于检验多种因素调节伤害性反应通路活性的神经机制。对于c l o s的研究做了一些工作，但对不同时空、不同机体状态下同一细胞和同一机体状态下不同细胞c一钿的表达是否相同，这一问趣值得进一步研究，对揭示针刺镇痛的本质有重要而深远的意义。I 不罔时辰电针前后
4、对。阳盘一、。阴虚。大囊曩的彤赡l 。l 材料与方法1 1 1 动物选择选用健康S D 成年大鼠，1 5 0 只中筛选出只，体重2 0 0 2 0 9 ，雄性。全价颗粒饲料均由四川 一9 1 7 一省输血研所实验动物中心提供。动物在实验前驯养1 周。并进行筛选，其标准是：以辐射热灯照射左后足部，测定在5 秒( 8 ) 左右能引起缩腿反应者用于实验。而少于2 s 大予1 0 s 者表示动物反应过敏或迟钝。则弃之不用。在光照时1 2 ：1 2 ( 黑暗期为1 9 ：0 0 7 ：0 0 ，光照期为7 ：0 0 1 9 ：0 0 ) 条件下驯养2 周，自由饮水，取食。1 1 2 分组及处理实验开始时
5、，将动物随机分为以下3 组，并分别予以相应处理。A 正常对照组：8 只时辰，不造模。于实验前与造模组同样方法固定2 0 m i n 。B 阳虚组：8 只时辰。造模与醋酸氢化可的松注射液( 江苏扬州制药厂，批号9 6 0 4 2 9 1 ) ，肌肉注射，用量2 0 m e k gb w d ，用药1 0 天，停药1 0 天后电针2 0 r a i n 。，C 阴虚组：8 只时辰，造模，促肾上腺皮质激素( A C T H ) ( 上海生物化学制药厂，批号：9 6 0 5 3 1 9 ) 腹腔注射，用量1 6 微克I gb w d ，用药4 天后电针2 0 r a i n 。1 1 3 电针方法先将
6、大鼠用鼠夹固定，选取左后肢的“太溪”、“足兰里”，取穴依据 【4 】，并参照人体有关穴位，以动物比较学方法定位。( 太溪足少阴肾经之原、俞穴配以足阳明胃经多气多血之经的合穴足三里，二穴相配，阴阳上下，共同达到镇痛作用) ，用0 5 寸毫针，直刺0 3 0 5 c m 。连接W Q 一1 0 C 型多用电子穴位测定治疗仪选用疏密波型频率2 0 1 0 0 H z 交替。电压2 4 V 。波宽0 2 0 6 m s 。电针时间2 0 m l n 。1 1 4 指标检测方法1 1 4 1 痛阈的测定一在大鼠左后足掌心处固定点，用自制弹簧棒测定。测定时。让动物保持安静测试者将弹簧棒均匀下压，直至动物发
7、生缩腿反应，共测3 次，每次间隔5 分钟，取其均值。1 1 4 2 实验数据的统计方法实验数据采用多个样本均数比较，方差分析，q 检验( N e 帆眦一K e e l 8 法) ，t 检验及t 检验处理和单个余弦法处理。1 2 结果与分析1 1 不同时辰电针对“阳虚一、。阴虚”大鼠刨伤痈针捌前后痛阈的影响( 叉S D )0 1 2注：与针前组比* P O 0 5 。* * P 0 0 1 ；与 组比P O 。0 5 ， 0 0 1 ；与B 组比P 0 0 5 ，P 0 从表1 1 得出，A 组、B 组和C 组在针刺前后痛阈有不同的昼夜节律变化。针前：A 组痛阈 一9 9 一值波动不大，子卯较高
8、、午酉较低；B 组痛阈值较A 组高，其中午时最高；c 组痛阈值较A 组低，其中卯时最高( P o 0 1 ) ；针后：A 组痛闽增加( 除午时外) ，其中酉时较针前有显著性差异( P O 0 5 ) ，具有昼夜节律性；B 组针后痈阈明显升高( 除午时外) ，其中午时( P 0 0 5 ) 和卯时( P 0 0 1 ) 有统计学意义，c 组痛阈明显升高，具有昼夜节律性，其中午时( P 0 0 5 ) 和酉时( P ， 0 0 1 )有显著性差异。“阳虚”组与“阴虚”组比较，“阳虚”组针后痛阈最高在卯时，“阴虚”组痛阈最高在酉时，两组相比针效正好呈1 8 0 0 , 提示“阳虚”组在卯时针刺效果最
9、佳；。阴虚”组在酉时针刺疗效最宏。2 不同时辰电针抑制“阳虚”、。阴虚”大鼠创伤痛诱导的下丘脑F o e 蛋白表达的影响2 1 材料与方法2 1 1 动物选择选用健康S D 成年大鼠2 2 4 只，其余同实验l 。2 1 2 分组及处理实验开始时将动物随机分为7 组，按四个时辰( 子、卯、午、酉) 分别处理。A 正常对照组：8 只时辰，不造模，于实验前与电针同样方法固定，2 0 m i n 。B 正常+ 刨伤截肢组：8 只时辰，于实验前3 0 m i n 在大鼠左后足踝关节下0 5 e m 行截肢术，压迫止血。与电针组同样方法固定2 0 m i n 。C 正常+ 截肢+ 电针组：8 只时辰。D
10、 阳虚+ 截肢组：8 只时辰。E 阳虚+ 截肢+ 电针组：8 只时辰。F 阴虚+ 截肢组：8 只时辰。G 阴虚+ 截肢+ 电针组：8 只时辰。2 1 3 主要试剂免抗c 一抗体( 购自北京中山生物技术有限公司，为S A N 队( R U 2 产品) A B C 试剂盒( 含D A B 染色剂，为华美生物工程公司产品) ，其它试剂均为进口分装或国产分析纯。 l 。4 灌注取材及切片用0 3 戊巴比妥钠以3 0 m g 蚝剂量麻醉大鼠。麻醉后将大鼠仰卧放置，开胸经左心室进行主动脉插管，剪开右心耳，首先迅速灌注1 0 0 n d 灭菌生理盐水，然后灌注2 5 0 , - 1 。4 。C 4 多聚甲醛
11、( P F A ) 固定液，灌注后取大鼠脑，在同一固定液中后圊定6 1 2 h ，然后浸入2 0 蔗糖P B S 液中直至组织块下沉。在恒冷箱切片机( 一1 7 一一2 2 ) 内做脑连续切片( 按照P a x i n o e 和W a t s o n 的鼠脑图谱【3 】，选取所需的切面) 。片厚2 0 p 哇n 。切片下后再人上述固定液中固定4 6 h 备用。2 1 5 指标检测方法2 1 5 1c f o e 检测法( 免疫组织化学A B C 法)切片入0 0 1 m o L LP B S ( p i E 4 ) 中洗1 0 m i n 3 次；0 3 t r i t o n x 一1 0
12、 0 中3 0 m i n ；0 3 H 2 0 2 一P B S 液中1 5 r a i n ；0 0 1 m o L LP B S 中洗1 0 m i n 3 次；入正常羊血清P B S 液中孵育2 0 r a i n ；进兔抗c一如抗体中孵育；0 0 1 m o l LP B S 洗1 0 m i n 3 次；人生物素标记羊抗兔I g G 中孵育；0 0 1 m o W LP B S 洗1 0 r a i n 3 次，人A B C 复合物中孵育；0 0 1 m o l LP 粥洗l O m i n 3 次；D A B 染色；双蒸水终止染色，用铬明胶将切片贴予载玻片上，过液凉干；梯度酒精脱
13、水；- - q j 苯透明；中性树胶封片。2 1 5 2 免疫组化对照试验- - 9 9 - 一2 1 5 3 非特异性对照用正常羊血清代替c 一钿抗体，其它步骤与免疫组化A B C 法程序相同。2 1 5 4 阴性对照用P B S 代替c f 0 6 抗体。其它步骤与免疫组化A B C 法程序相同。2 1 5 5F o s 样免疫反应性( 眦) 的性细胞计算方法，在每一动物的组织切片中随机抽样4 张，每张切片选下丘脑区域的左上、右上，左下。右下和中央部五个视场进行阳性细胞计数取平均值。其图像处理均在四川联大计算机图像处理中心进行处理。2 2 结果与分析表2 1 不同时辰电针各组大鼠下丘脑F
14、L I 的影响( 又4 - S D )从表2 1 得出，A 组其表达很少，子时最低，卯时最高。造模组：B 组午时最高。卯时最低；D组，午时最高，子时最低；F 组卯时最高，午时最低i 针利组：C 组午时降低最甚( P 0 0 1 ) ；E 组卯时降低为甚( P 0 0 1 ) ；G 组酉时降低为甚( P 0 0 1 ) 。“阳虚”、“阴虚”组针前后。存在相对立的关系。“阳虚”组其最佳降低下丘脑F L I 的时辰是卯时，“阴虚”组其最佳时辰是酉时。与痛阈吻合。 表2 2 不同时辰电针各组下丘脑m 余弦法节律参数组别测数P RPF中值土S E掇幅( 粥c L )峰相位( 9 5 C L )3 6 0
15、 度= 2 4 小时相位参考：0 0 0 = 度从表2 2 ：A 组元昼夜节律，振幅0 9 2 ，峰相位在7 ：左右；造模组：B 组有昼夜节律，振幅升高2 9 ，峰相位在8 ：0 0 1 4 ：0 0 之间；D 组有昼夜节律。振幅l O ，峰相位在1 0 ：0 0 1 3 ：0 0 之间；F组有昼夜节律，振幅4 6 ，峰相位在0 ：0 0 5 ：0 0 与B 、D 组比有差异( P O 0 S ) 。针刺组：c 组有节律性，峰相位在1 0 ：0 0 1 2 ：0 0 之问，E 组有节律性。峰相位在1 3 ：0 0 一1 6 ：0 0 与c 组有差异( P 0 0 5 ) ；G 组有节律性，峰相位在9 ：0 0 2 1 ：0 0 之间与F 组有差异( P 0 0 5 ) 。“阳虚”组和“阴虚”组比较，造模时两者峰相位有差异( P 0 o s ) 。“阳虚”组其峰相位在午时 一1 0 0 左右，“阴虚”组其峰相位在子时左右，针刺后两者元明显差异，提示“阳虚”和“阴虚”创伤痛在下丘脑F L I 表达存在相互对立的关系。 3 讨论针刺的镇痛效应及其中枢的重要物质基础已经研究得比较清楚，针刺镇痛的昼夜波动性亦做了一些工作，但在不同机体的病理状态下针刺镇痛的昼夜波动性尚未见报导。本研究以中医疼痛理论为指导，借助免疫组织化学等先进检测技术_ 为手段，深入探讨针刺镇痛对体质和时间作用的机理。使
