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1、1青蒿素及其衍生物抑瘤作用机制的研究 进展【关键词】 青蒿素； 衍生物； 抑瘤机制青蒿素是从菊科植物黄花蒿的叶和花蕾中分离获得的一种倍半萜内酯过氧化物，其衍生物包括：双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等。目前，青蒿素及其衍生物作为高效低毒的抗疟药已经得到了全世界的公认。近年来不断有研究证实青蒿素及其衍生物对多种肿瘤具有抑制作用，并从不同方面揭示出其抑瘤活性的可能机制。1 抑制肿瘤细胞生长增殖的可能作用机制体内试验结果表明，青蒿素及其衍生物对抑制肿瘤细胞增殖是明显有效的，但在相同的给药方式下，高剂量组与低剂量组的抑瘤率差异不显著1；而在体外实验中却表现出明显的量效关系112。青蒿素及其不同衍生物的抑瘤
2、活性也不同，顺序为：双氢青蒿素青蒿琥酯青蒿素2，3，10。1.1 药物的立体化学结构影响肿瘤细胞的增殖周期青蒿素及其衍生物的立体化学结构是其抑制肿瘤细胞增殖的作用基础，尤其是醚键结构连接的二聚体。有此种醚键结构的非对称二聚体和对称二聚体双氢青蒿素均可导致 G1 期肿瘤细胞堆积，而青蒿素仅造成 S 期细胞轻微增多，说明醚键结构在对肿瘤细胞增殖周期的影响中起到了重要的作用。1.2 PCNA 的降低抑制肿瘤细胞 DNA 的合成增殖细胞核抗原(PCNA)是 DNA 多聚酶 辅助蛋白，是 DNA 合成必不可少的因2子，其在细胞内的表达量反映了细胞的增殖活性。用免疫组化染色法检测青蒿琥酯作用后小鼠肝癌细胞
3、 H22 中 PCNA 的表达，实验结果表明：青蒿琥酯能明显抑制 PCNA 表达1，从而降低 DNA 多聚酶 的活性，抑制肿瘤细胞 DNA 的合成，导致了肿瘤细胞的增殖抑制。1.3 基因种类影响肿瘤细胞的生长及耐药性青蒿琥酯抑制肿瘤细胞增殖的分子基础可能是某些 DNA 修复调节基因和细胞增殖基因。Efferth 等通过选取 NCI 数据库中的 465 种基因，检测它们在美国国立癌症研究所发展治疗项目的 55 种肿瘤细胞中的 mRNA 表达，分析与青蒿琥酯作用之间的关系。结果表明，青蒿琥酯的半抑制浓度(IC50)与细胞倍增时间、细胞周期的 G0/G1 都有明显相关性，并且 54 种基因的表达与青
4、蒿琥酯的 IC50 值明显相关，变异缺失的表皮生长因子受体 cDNA 和谷胱氨酸合成酶 cDNA 可提高肿瘤细胞对青蒿琥酯的抗性，而 CDC25A 基因可提高肿瘤细胞对青蒿琥酯的敏感性，表达 MDR1、MRP1 或 BCRP 基因的多耐药肿瘤细胞对青蒿琥酯没有交叉耐药13。氧化应激在青蒿琥酯抗肿瘤机制中起到一定的作用，抗氧化防御作用与对青蒿琥酯的细胞应答有关14。比较 55 种细胞系的抗氧化基因的表达与青蒿琥酯的IC50 之间的关系，结果显示，硫氧化蛋白还原酶基因的表达与青蒿琥酯 IC50 呈明显正相关，而过氧化氢酶基因的表达与青蒿琥酯 IC50 呈负相关12，表明氧化应激程度较高的肿瘤细胞对
5、青蒿琥酯的抗肿瘤增殖作用较敏感。另外，肿瘤细胞中针对青蒿素及其衍生物(特别是青蒿琥酯)的耐药基因较少，从而使肿瘤细胞对青蒿琥酯的作用更加敏感13。Efferth 等的分析表明，青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿乙醚均可抑制上述 55 种肿瘤细胞的增殖，3 种药物对肿瘤细胞生长的 IC50 值顺序为3青蒿琥酯蒿乙醚蒿甲醚，促使肿瘤细胞中耐药基因数量增长的程度亦遵循此规律15。故可推断青蒿琥酯的活性较其他两种药物强的原因，可能是肿瘤细胞中较少耐药基因影响青蒿琥酯的结果。2 对肿瘤细胞直接细胞毒作用的可能机制2.1 转铁蛋白和铁增强对肿瘤细胞的毒性作用癌细胞需要大量铁质才能复制染色体进行细胞分裂，故癌细胞内铁浓度
6、较正常细胞高出许多。二氢青蒿素对正常人乳腺细胞 HTBl25 没有明显的细胞毒作用，但对人乳腺癌细胞 HTB27 表现了很强的杀伤能力，若二氢青蒿素与转铁蛋白共同作用，则可明显提高对肿瘤细胞的这种杀伤作用。Sadava 等检测了青蒿琥酯对H29(药物敏感株)和 H29VP(多重耐药株)两种小细胞肺癌细胞株的作用，并预先用转铁蛋白提高了细胞内二价铁离子的水平。结果显示，低剂量的青蒿琥酯对单纯小细胞肺癌即可发挥细胞毒作用，对 H29VP 细胞的 IC50(24 nM)是 H29 细胞IC50(23 nM)的 10 倍。预先用 220880 nM 转铁蛋白处理的 H29 细胞的青蒿琥酯 IC50 无
7、变化，而对青蒿琥酯具有耐药性的 H29VP 细胞在转铁蛋白预处理后，IC50 降到药物敏感水平(880 nM 转铁蛋白预处理 4 h 后 IC50=5.4 nM)。5 M 去铁铵可抑制转铁蛋白对青蒿琥酯杀伤耐药肿瘤细胞的促进作用，但对青蒿琥酯敏感肿瘤细胞株无影响16。近期研究表明，许多过表达转铁蛋白受体的肿瘤细胞，如白血病细胞株 CCRFCEM 和星形细胞瘤细胞株 U373，只有在应用了高剂量青蒿素，并和铁剂合用后才有一定的治疗效果17，18。线粒体乌头酸酶和血浆铜蓝蛋白(亚铁氧化酶)等可促进铁的吸收利用及新陈代谢的因子，亦可提高青蒿素及其衍生物的直接杀伤肿瘤细胞活性18。42.2 药物的立体
8、化学结构与肿瘤细胞毒性作用有关内过氧基团在青蒿素的肿瘤细胞毒作用中发挥着重要作用，缺乏内过氧桥的去氧青蒿素的细胞毒活性明显不如青蒿素，同样缺乏内过氧桥的双氢去氧青蒿素的细胞毒活性也明显不如双氢青蒿素。二聚体醚键结构则是较内过氧化基团更重要的决定性因素，检测青蒿素及其衍生物影响 Ehrlich 腹水瘤细胞的细胞毒作用的研究中发现，双氢青蒿素非对称二聚体较对称二聚体有更高的细胞毒活性，缺少内过氧桥的非对称二聚体双氢去氧青蒿素的细胞毒作用，虽然不如含有内过氧桥的非对称二聚体和对称二聚体，但仍有明显的肿瘤细胞毒性作用。另外，去氧青蒿素和羧丙基去氧青蒿素对肿瘤细胞的细胞毒活性不仅仅依赖于药物的亲脂活性，
9、而且与受体构象和容量有关，特别是与能够影响其环形结构的羧丙基或羰基构象及其稳定性有关，提示青蒿素及其衍生物对每一种肿瘤细胞的作用均有其特定的靶分子。3 诱导肿瘤细胞凋亡的可能作用机制3.1 导致 Bcl2/Bax 基因表达比例下降青蒿琥酯对人肝癌细胞 BEL7402 中 P53 蛋白表达水平无影响，表明青蒿琥酯诱导 BEL7402 细胞凋亡是通过非 P53 依赖途径。免疫组化检测结果显示，青蒿琥酯作用后小鼠肝癌细胞 H22 中 Bax 基因表达增多，Bcl2 基因表达减少，Bcl2Bax 比例下降1。因此，青蒿琥酯可能通过影响 Bcl2 和 Bax 基因的表达，经非 P53 依赖性途径诱导癌细
10、胞凋亡。 3.2 减少 survivin 基因表达和 survivin蛋白合成5survivin 蛋白具有在成年终末分化的正常组织中不表达，而在大多数人类癌细胞中高表达的特点，且与肿瘤恶性程度、化疗药抗性有关，能直接抑制Caspase3、Caspase7 而发挥抑制肿瘤细胞凋亡的作用21。青蒿琥酯作用于HL60(早幼粒白血病细胞株)24 h 时后，可使细胞浆中 Caspase3 的活性呈浓度依赖性增强；作用于 A549(肺腺癌细胞株)72 h 后，可使细胞内 survivin mRNA 的表达呈浓度依赖性降低，survivin 蛋白表达明显受到抑制22。提示青蒿琥酯可通过对 survivin
11、基因水平的抑制从而抑制其蛋白表达，解除了 survivin 蛋白对Caspase3 的抑制作用，最终诱导肿瘤细胞的凋亡。3.3 提高肿瘤细胞内的钙离子浓度细胞内钙离子浓度的升高是细胞凋亡信号转导过程中的重要环节。周晋等用激光共聚焦显微镜观察青蒿素对人白血病细胞株和原代细胞的影响，结果显示：NB4、K562、APL 细胞内钙随青蒿素浓度的增加而增高，随药物作用持续时间的延长而增高，尤以 5 mol/L 时最为突出，表明青蒿素可能是通过提高细胞内钙浓度而引起肿瘤细胞凋亡8。3.4 诱导肿瘤细胞内线粒体跨膜电位的下降线粒体跨膜电位下降可导致促凋亡物质释放、caspase 激活，导致细胞凋亡的增多。董
12、海鹰等用 Rhodamine(Rhl23)染色法检测线粒体跨膜电位的变化结果显示，青蒿素可导致 K562 细胞凋亡，同时线粒体膜电位下降，且呈剂量和时间依赖关系，说明青蒿素可通过促使肿瘤细胞线粒体的跨膜电位下降而诱导 K562 细胞凋亡9。64 抑制肿瘤组织血管生成的机制肿瘤的生长与转移依赖肿瘤新生血管生成，以满足肿瘤组织异常旺盛的生化代谢需要，最终导致瘤细胞的恶性增殖及转移。抑制血管生成能有效抑制肿瘤生长和转移，因此，抗血管生成疗法已成为治疗肿瘤的新策略。近期研究表明，青蒿琥酯可通过对肿瘤的血管生成的抑制作用而发挥抗肿瘤效应。血管内皮生长因子(VEGF)及其受体 KDR/flt1 是血管生成
13、过程中重要的调节因子，通过抑制 VEGF 分泌或下调其受体表达，可有效破坏肿瘤新生血管的形成23。Chen 等用人卵巢癌 HO8910 的裸鼠移植瘤模型和免疫组化法研究青蒿琥酯的体内抗血管生成作用，结果显示，青蒿琥酯 50 mg/(kgd)即可明显减少肿瘤的血管生成，抑制肿瘤生长，且肿瘤细胞浆内 VEGF 蛋白、肿瘤细胞及血管内皮细胞表面的 KDR/flt1 蛋白表达均明显减少24。说明青蒿琥酯可能是通过对 VEGF 及其受体 KDR/flt1 蛋白的抑制而发挥其抗肿瘤血管生成作用的。青蒿素及其衍生物与那些已经证实有抑瘤效果的药物相比，作用相当甚至更有效，并且一些对化疗药物耐药的肿瘤细胞系没有
14、显示出对青蒿素及其衍生物的交叉耐药12。因此，由于青蒿素及其衍生物的安全、高效、不易产生抗药性、副作用较小的作用特点，如果将其应用范围扩展到抗肿瘤治疗上，应当有十分广阔的应用前景。目前的研究结果显示，青蒿素的抗肿瘤活性可以表现在对肿瘤细胞的直接细胞毒性作用、影响肿瘤细胞的增殖周期、促进肿瘤细胞凋亡及抗肿瘤血管生成作用等多个方面，涉及到细胞、分子、基因等不同层次，但是否还能通过其他途径发挥抗瘤效应尚有待进一步探讨。因此还应充分利用现代先进的分子生物学及免疫学新技术，进行更广泛更深入的研究，为临床应用其进行肿瘤治疗提供更有力的支持。【参考文献】1 王勤，吴理茂，赵一，等.青蒿琥酯抗肿瘤作用的机制研
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16、用 MTT 法分析青蒿素对人癌细胞系 Hela 细胞的体外细胞毒作用.中国肿瘤临床与康复，2004,11(1)：3031.7 冯文宇，王琳，孙琴，等.青蒿油乳抗人肝癌细胞增殖生长抑制试验.泸州医学院学报，2003,26(5)：395396.8 周晋，孟然，李丽敏，等.青蒿素对人白血病细胞株和原代细胞的影响.中华内科杂志,2003，42(10)：713714.9 董海鹰，王知非，宋维华，等.青蒿素诱导 K562 细胞凋亡研究.中国肿瘤，2003,12(8)：473475.10Chen HH，Zhou HJ，Fang X.Inhibition of human cancer cell line growth and human umbilical vein endothelial cell angiogenesis by artemisinin derivatives in vitro.Pharmacol Res, 2003，
