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1、1黄芪多糖对大鼠损伤坐骨神经再生的作 用研究作者：桑秋凌，魏壮，许则民，刘飙，刘浩宇，李满，尹维田【摘要】 目的观察黄芪多糖（APS-P）对大鼠坐骨神经损伤后神经再生的影响。方法建立大鼠坐骨神经损伤模型，将雌性 Wistar 大鼠 24 只随机分为损伤对照组和实验组（黄芪多糖组）。实验组给予腹腔注射黄芪多糖 20 mg/kg，对照组给予同体积生理盐水。1 次/d 连续给药 28 d。分别于术后 4，8，12 周用电生理学、形态学方法评估坐骨神经再生和功能恢复情况。结果术后坐骨神经传导速度(MNCV)、有髓神经纤维数目在各时间点上黄芪多糖组均优于对照组(P0.05)。结论黄芪多糖可以促进损伤神经
2、的再生。 【关键词】 黄芪多糖 周围神经 损伤 再生Abstract:ObjectiveTo study the effect of Astragalus polysaccharides on nerve regeneration.Methods24 female Wistar rats were randomly divided into control group and Astragalus polysaccharides group.Sciatic nerve injury model was set up. Then 20mg/kg of Astragalus polysacchar
3、ides were intraperitoneal injected every day after nerve injury for 28 days;the same volume of saline was injected to the control group.Electrophysiological,histological examinations and functional evaluation were used to assess nerve regeneration in 4,8,12weeks of operative intervals respectively.R
4、esultsThe recovery rate of sciatic motor nerve conduction velocity(MNCV),numbers of myelinated nerve were significantly higher in Astragalus polysaccharides group in all the time points than those of control group (P0.05).ConclusionAstragalus polysaccharides has effect of promoting regeneration of i
5、njuried peripheral nerve.Key words:Astragalus polysaccharides； Peripheral nerve； Injury； Regeneration目前周围神经损伤修复后功能恢复仍不理想，促进神经纤维再生和提高再生质量对损伤功能恢复有重要意义。有研究表明黄芪作为君药与其它中药配伍可以2促进周围神经再生。为了探讨黄芪的主要生物活性成分黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)在周围神经修复过程中的作用，我们设计如下实验，观察黄芪多糖对周围神经损伤后修复的影响。1 材料与方法1.1 用药美国泛华医药公司出品，美国泛
6、华医药公司与山西省中医药研究院共同研制开发的注射用黄芪多糖粉针剂（APS-P）z20040086 号，为类白色无定形粉末，无嗅，无味，其主要成分为 -1，4（1，6）葡聚糖、阿拉伯-半乳多糖、鼠李-半乳糖醛酸多糖和阿拉伯-半乳蛋白多糖所组成，平均分子质量为 26 万。1.2 模型制作 Wistar 大鼠 24 只，体重 120130 g，全部雌性，随机分为两组，即实验组（黄芪多糖组）和对照组（生理盐水组）。每组再随机分为 3 个亚组，即 4周组、8 周组、12 周组。1%氯胺酮 40 mg/kg 腹腔注射麻醉,分别在大鼠左、右两侧股外侧肌间隙进入显露双侧坐骨神经，在坐骨结节下 1.0 cm 处
7、切断神经干，取同种异体鼠腹主动脉桥接坐骨神经，神经远近端之间留有 2.0 mm 间隙，以 9-0 显微缝线制成小间隙桥接双侧坐骨神经损伤模型。术后第 1 天开始用药，实验组给予腹腔注射黄芪多糖 20 mg/kg，对照组给予同体积生理盐水。1 次/d 连续给药 28 d。1.3 检测项目与检测方法在 4，8，12 周时分别观察大白鼠的下列指标。1.3.1 一般情况攻击性、步态、足趾与足跟溃疡的发生、发展以及恢复情况、肌3肉的萎缩与恢复情况、局部感染和死亡情况。1.3.2 神经电生理检测利用 MedtronicKeypoint 肌电图仪，实验动物双侧坐骨神经均作检测。方法：1%氯胺酮腹腔麻醉动物后
8、，无菌消毒术野，俯卧位分别暴露坐骨神经总干，采用同芯针电极刺入大鼠比目鱼肌肌腹内作为记录电极，以平行刺激电极分别于吻合口近侧坐骨结节水平及远侧坐骨神经分支处给以超强刺激(电流为 50 mA)，通过潜伏期差仪器自动计算出运动神经传导速度(MCV)。室温保持 24。1.3.3 组织学观察各组动物切取吻合口远端神经，经固定脱水包埋后分别作切片 HE 染色，光镜观察非神经细胞、无髓和有髓神经轴突在神经再生过程中的变化。通过 HPIAS-1000 高清晰度彩色病理图文分析系统。1.3.4 透射电镜观察取吻合口远端 3 mm 神经按电镜标本常规固定、脱水、包埋后作超薄切片。FEI 公司生产(飞利浦公司)的
9、 TECNAI G2 透射电子显微镜观察再生神经的超微结构。1.3.5 统计学分析采用两组独立样本的 t 检验分析比较，结果以s 表示，P0.05 统计学差异显著。2 结果2.1 大体观察术后两组动物均有后肢肿胀，步态不稳，体毛稀疏光泽变差，足趾溃疡，足趾脱落改变。但实验组鼠一般状态、攻击性较对照组恢复快。足趾溃疡和脱落数目实4验组（3 鼠 4 侧）要少于对照组（5 鼠 7 侧）。取材时见两组动物神经吻合口均愈合良好，无神经瘤形成，实验组神经表面血管较丰富，神经与周围组织轻度黏连。见图 1。2.2 肌电图检测结果运动神经传导速度（MNCV，m/s）4 周时实验组为（28.955.30） m/s
10、，对照组为（15.355.78）m/s，t 值 2.896， P0.05；8 周时实验组为（40.206.23） m/s，对照组为（25.95 4.34）m/s，t 值 2.830，P0.05；12 周时实验组为（49.638.61）m/s，对照组为（36.904.721）m/s，t 值 2.752,P0.05，统计学差异显著。 2.3 组织学检测结果光镜下术后 12 周纵切片（40）可见实验组（图 2）有髓神经纤维较多，排列规则；对照组（图 3）有髓神经纤维数量较少。图像分析再生有髓神经纤维数目：术后8 周、12 周实验组8 周为（149.0022.16），12 周为（180.1421.35
11、）优于对照组8周为（111.8622.41）12 周为（159.5720.72）。P0.05，统计学差异显著。2.4 电镜观察结果术后 12 周实验组（图 4，6）髓鞘较厚，板层致密，明暗板清晰。对照组（图 5，7）髓鞘较薄，扭曲变形明显，板层疏松，点状分离,成熟度欠佳。3 讨 论周围神经损伤后再生是一个涉及多因素的复杂过程。如何促进神经再生，提高神经损伤后的治疗效果，仍然是众多医者孜孜探索的重点。中药及其提取物来源5广泛，价格低廉，临床应用历史久远，作用机制多途径，有着不可轻视的作用。黄芪多糖（APS）作为黄芪的主要有效成分，对机体免疫功能有广泛的调节作用1。本次实验观察到其对周围神经损伤后
12、再生有比较积极的影响。3.1 黄芪多糖促进周围神经再生效果及作用机制本次实验首先从整体上将APS 组和对照组的各项检测数据进行分析比较，结果显示 APS 组和对照组相比神经再生质量较好。然后通过对相应时间亚组在固定时间点上的两两比较，发现实验组动物 4 周时运动神经的传导功能即有较好的恢复。光镜和电镜观察到 8 周和 12 周时实验组神经髓鞘成熟度明显好于对照组，实验组神经髓鞘较厚，排列紧密，板层致密，间质增生较少。虽然两组大鼠损伤的神经都有一定程度的再生，但再生的速度和质量有所不同。从功能学和形态学的角度可以说明实验组与对照组相比神经恢复较早且质量较好，黄芪多糖对周围神经的恢复起到积极的促进
13、作用，且在神经损伤早期即发挥作用。周围神经损伤后免疫系统发生巨噬细胞聚集，淋巴细胞活化等一系列变化2。分析黄芪多糖促进周围神经再生的机制并不是药物对神经的直接刺激作用，而是通过作用于免疫系统，进而影响复杂的细胞因子网络来发挥作用的。大概为以下几个方面：从细胞免疫角度看，活化巨噬细胞，促进巨噬细胞产生各种细胞因子。IL-1 能增加血管的通透性，诱导巨噬细胞至损伤部位并使之活化，从而有利于吞噬破碎的髓鞘组织，并启动其它多种细胞因子的表达3。并且 IL-1 是雪旺细胞的致有丝分裂原，能诱导雪旺细胞分泌神经生长因子4，有利于加快神经轴突的生长和再髓鞘化；促进巨噬细胞产生 IL-6 和白血病抑制因子(L
14、IF)， IL-6 和 LIF 能作为中介质通过趋化调节雪旺细胞而吸附巨噬细胞5，加强巨噬细胞6对华勒变性细胞碎片的吞噬，具有诱导神经细胞分化，维持神经元生存、分化、生长、成熟6和促进周围神经再生7作用；提高 T 淋巴细胞的转化，纠正 T 淋巴细胞转化的受抑状态,增强 T 淋巴细胞增殖8。上述细胞因子变化亦与 T 细胞反应有关。从信号转导方面看，能增加细胞内 cAMP 含量9。cAMP 通路是神经细胞信号转导的重要通路，调节的效应物是 PKA。cAMP 通过活化 PKA 使PKA 底物蛋白磷酸化而实现促进神经轴突生长效应；提高细胞内游离钙离子水平，活化 PKC10。PKC 在周围神经的传入传出
15、神经内大量分布，通过影响生长相关蛋白 43 与层黏连蛋白(Laminin)来促进轴突生长，促进雪旺细胞增殖和 DNA合成11。PKC 的底物很多，例如表皮生长因子受体，胰岛素受体，转录因子，翻译因子等，因而其介导的细胞效应也十分广泛。这些信号分子在细胞内逐步转导产生再生效应。另外，IL-1 与巨噬细胞膜上的相应受体结合后，通过 Ras-MAPK信号传导途径，诱导活化蛋白-1(AP-1)，NF-gB 和 NF-IL6 转录因子等，活化多种免疫分子的启动子，从而促进其基因表达，具有显著提高巨噬细胞吞噬能力的作用12。3.2 黄芪多糖的研究与应用前景目前，神经损伤后的治疗药物主要分为两种，即生物制剂
16、如神经生长因子、脑活素等和非生物制剂如 B 族维生素类等；生物制剂价格昂贵，疗效并不确切，尚未被广泛用于临床。B 族维生素虽临床应用久远，但疗效亦不理想。我们旨在寻找一类来源广泛效果可靠的促周围神经再生的药物。通过研究发现黄芪多糖具备这样的特点，能通过对神经功能的康复，提高患者生活质量，减少伤残率，因而具有极大的社会效益和广阔的应用前景。黄芪多糖作为免疫增强剂已被应用于临床且效果稳定，其促神经修复机制有待进一步探讨。【参考文献】71单俊杰,王顺春,刘 涤,等. 黄芪多糖的化学和药理研究进展J.上海中医药大学学报,2000, 14 (3):61.2刘飙,尹维田,崔凤双,等.周围神经损伤后免疫系统变化的动物实验观察J.白求恩医科大学学报, 2000,26(5):485.3Schnell L，Fearn S,Schwab ME，et a1Cytokine-induced acute inflammation in the brain a
